[发明专利]一种具有趋化作用的人类RANTES蛋白的异源表达和纯化方法

摘要

本发明涉及一种具有趋化作用的人类RANTES蛋白的异源表达和纯化方法。采用具有高表达、高稳定、高分泌和低成本的毕赤酵母表达体系，通过RT-PCR克隆人RANTES基因、人RANTES融合蛋白表达载体构建、人RANTES融合蛋白的甲醇诱导表达以及纯化鉴定等分子生物学技术和蛋白表达与纯化技术，实现人RANTES蛋白的分泌表达。为了便于人RANTES蛋白的分离纯化，在目的蛋白N端融合一个6×His纯化标签，并在His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶(EK)酶切位点构建RANTES融合蛋白，然后通过亲和层析和EK酶切得到纯度较高、产量较大的人RANTES蛋白，该蛋白可用于制备治疗多发性硬化关节炎、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾病、肿瘤以及HIV药物的用途。

主权项

1.一种具有趋化作用的人RANTES蛋白的异源表达和纯化方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1).人RANTES基因的克隆根据人类RANTES基因序列设计引物，以人体血液提取RNA为模板，RT-PCR方法扩增人类RANTES基因片段，并连接到pMD18-T载体上形成重组质粒pMD18-T/rantes；(2).人RANTES融合蛋白表达载体的构建在人RANTES蛋白N端融合6×His纯化标签，并在His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶(EK)酶切位点，以重组质粒pMD18-T/rantes为模板，PCR扩增出人类RANTES融合蛋白基因，将该融合蛋白基因与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒pPIC9K/rantes，构建策略见图2；(3).人类RANTES融合蛋白的诱导表达和分离纯化电转化表达系统的宿主，经G418筛选得到高表达的阳性克隆，在摇瓶中融合蛋白高效、分泌性表达；然后采用超滤和亲和层析纯化人类RANTES融合蛋白；(4).人RANTES蛋白的分离纯化利用肠激酶酶切人类RANTES融合蛋白，然后经亲和层析去除6×His-tag，纯化到人类RANTES蛋白。