[发明专利]一种具有趋化作用的人类RANTES蛋白的异源表达和纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程制药领域，具体涉及一种具有趋化性的人类RANTES蛋 白的异源表达和纯化方法。

背景技术

多发性硬化、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾病、肿瘤以及 艾滋病HIV等疾病是多种危害人类健康的重要疾病，这些疾病给人类带来了极大 的痛苦，每年大量的人由于这些疾病夺去健康和生命，特别是HIV，至今尚无有 效的治疗方法。多年来，研究人员花了大量人力物力致力于研究治疗这些疾病 的方法。

趋化因子(chemokine，CK)是一组具有趋化作用的细胞因子，能趋化免疫细 胞到免疫应答反应局部，参与免疫调节和免疫病理反应。他们多为小于100个氨 基酸的小分子蛋白质。根据其分子一级结构中N-端前两个半胱氨酸残基(Cys) 间是否隔有其他氨基酸，可以将趋化因子分为4个亚族(共50余种)即 Cys-X-Cys(CXC)，Cys-Cys(CC)，Cys(C)，Cys-X3-Cys(CX3X)亚家族。他们不仅参 与炎症反应，也参与免疫，造血，血管生成，器官发育等生理，病理过程。其 中趋化因子RANTES(regulated upon activation nomal T cell expressed and secreced，RANTES)是CC类趋化因子亚族成员，又名CCL5，其分子量为8KD，近 年来才发现的一种趋化因子，它通过结合细胞表面的趋化因子受体诱发致炎性 免疫应答。诱导白细胞向炎症部位浸润，介导炎症反应的发生，对单核细胞、 巨噬细胞、记忆性T细胞、树突状细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞均有强烈的 趋化作用，并能调节效应细胞的功能，参与很多炎症反应。在很多疾病的病理 生理过程中起着重要作用，如多发性硬化、类风湿性关节炎、器官移植排斥、 心脑血管疾病、肿瘤以及HIV等，为临床治疗这些疾病展示了诱人前景。

RANTES是第一个被发现的对人类某些T细胞具有活性的趋化因子，他的这一 特征可能对于损伤和感染部位招引记忆性T细胞的聚集有重要作用。然而，自首 次发现十年后，RANTES才受到广泛重视，因为它能通过与CCR5受体竞争结合而 抑制巨噬细胞的R5HIV-1株进入细胞。随着对HIV-1的深入研究，有关RANTES结 构和功能的阐述也随之清晰。现有的研究结果表明，RANTES以单体，双聚体或 多聚体的形式，通过与相应的受体结合，可以发挥诱导白细胞活化，调节炎症， 调节免疫的作用，继而在多种感染性疾病，过敏性疾病以及免疫性疾病中起着 重要的作用。

目前蛋白的体外表达主要有大肠杆菌、杆状病毒、哺乳动物细胞和酵母四大 外源基因表达体系。关于RANTES蛋白的表达主要限于大肠杆菌表达体系，此体 系对于蛋白表达的翻译后加工机制不完善，产生的蛋白活性低，不利于后期的研 究工作。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是发展迅速应用广泛的商业化 重组真核宿主表达系统，是上世纪80年代被开发出的一种新型的外源蛋白表达 系统，该系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。主要具备以下优点：1) 属于真核表达系统，可对蛋白进行多种翻译后修饰；2)表达系统所需要的成本 低，只需要简单的盐培养基即可；3)高表达。他能利用很强的启动子，具有较 快的细胞生长速度，所以表达量也相对较高；4)高稳定。该系统的载体能和真 核基因组进行整合，构建的菌株相对稳定，一般不会出现外源基因随生长繁殖 而丢失的现象；5)高分泌。它可以利用多种信号引导外源基因分泌，其分泌量 可达10g/L，这在已知的分泌表达系统中是罕见的；6)适用于高密度连续发酵； 7)该系统自身分泌的背景蛋白非常少，诱导的培养基皆由小分子物质组成，成 分简单，纯化工艺简单易行。

因此本发明利用巴斯德毕赤酵母作为表达体系来表达人RANTES融合蛋白。

发明内容

本发明的目的，是提供一种具有趋化作用的人类RANTES蛋白的异源表达和 纯化方法。采用本发明方法可以得到纯度较高、产量较大的人RANTES蛋白，可 用于制备治疗多发性硬化关节炎、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾 病、肿瘤以及HIV药物的用途。

该方法主要包括以下步骤：

(1).人类RANTES基因的克隆

(2).人类RANTES融合蛋白表达载体的构建

(3).人类RANTES融合蛋白的诱导表达和分离纯化

(4).人RANTES蛋白的分离纯化