[发明专利]柑桔衰退病毒一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及一种用于柑桔衰退病毒的一步法实时荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化检测试剂盒及利用该检测试剂盒检测柑桔衰退病毒的方法，是专门针对柑桔衰退病毒建立的一种荧光定量检测方法和产品。检测时间仅需4h，特异性强、灵敏度高、稳定可靠。该方法克服了现有对柑桔衰退病毒依据症状学的常规诊断方法误判率较高、血清学方法灵敏度低等缺点，适合于柑桔种苗和传毒媒介昆虫的带毒状况的快速诊断，可以用于柑桔种苗质量检验和衰退病毒病的鉴别。

主权项

1.一种用于柑桔衰退病毒的一步法实时荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒，由以下试剂组成：柑桔样品中病毒RNA提取试剂，病毒RNA实时荧光定量RT-PCR固相化试剂，无害化柑桔衰退病毒阳性对照品，健康柑桔阴性对照品；其特征在于：所述样品病毒RNA提取试剂是用5mmol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.65％亚硫酸钠，在常温下的混合物。所述无害化柑桔衰退病毒阳性对照品由如下步骤制得：[1]提取含柑桔衰退病毒的总RNA；[2]设计扩增柑桔衰退病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端带有T7启动子序列：5’-GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCATGTATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’，下游引物序列为：5’-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’；[3]进行RT-PCR扩增得到柑桔衰退病毒DNA片段；[4]以柑桔衰退病毒DNA片段为模板进行体外转录得柑桔衰退病毒RNA片段，用作无害化阳性对照。所述病毒RNA荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化试剂的外观呈冻干胶珠；并且固相化反应试剂含有如下组分：组分 终浓度10×RT-PCR缓冲液 1×，25mM MgCl2 3mmo l/L，10mM dNTPs 0.3mmol/L，40U/μL RNA酶抑制剂 8Unit/25uL，200U/μL MMLV反转录酶 50Unit/25uL，10μM CTV引物对 0.2μmol/L，10μM Taq DNA聚合酶Man探针 0.12μmol/L，5U/μL Taq DNA聚合酶 1U/25μL，生物大分子稳定剂 加至25μL；所使用的引物为寡核苷酸引物对：5’-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’，5’-CCTCATAACGAAGAAGCCCA-3’；荧光探针5’(FAM)-CGGTTTACTCGCGA CAAGCTGCTC(TAMRA)-3’；所述生物大分子稳定剂由(重量/体积)0.05-0.1％明胶、0.1～0.2％多糖、0.02～0.05％牛血清白蛋白，其余为超纯水混合而成。