[发明专利]柑桔衰退病毒一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农业生物技术，具体的说，涉及一步法扩增柑桔衰退病毒的简单、快速的固相化核酸检测试剂盒，适合于植物保护、植物检疫及农产品质量技术监督等部门使用。

背景技术

我国柑桔栽培面积位居世界第一位，总产量居世界第二位；柑桔产业已成为我国南方三大柑桔生产带最重要的支柱产业。柑桔衰退病毒(英文名称Citrus tristeza virus，简称CTV)引起的柑桔衰退病是世界范围内的一种重要植物病害，主要由嫁接和蚜虫传播，其主要危害在于引起柑桔植株快速死亡或严重衰退，特别是以酸橙作为砧木的柑桔受害最重。受害植株木质部产生茎陷点，进而导致树势减弱、果品变劣；也可引起酸橙、葡萄柚和柠檬实生苗的苗黄症状。从20世纪30年代至今，柑桔衰退病已经毁灭了至少1亿株柑桔，经济损失超过数亿美元，严重威胁着世界上以酸橙为砧木的柑桔产区和对CTV茎陷点株系敏感的葡萄柚、甜橙等品种的安全。目前没有有效的抗病品种，弱株系保护品种尚未问世，化学防治仅对媒介昆虫有效，因此生产上迫切需要特异、灵敏和准确的检验方法来早期快速准确的诊断CTV，为控制病害流行、确保柑桔生产的安全提供技术支撑。

目前针对CTV检测方法有电子显微镜检验法、血清学法、指示植物症状判断法等。由于病毒在柑桔内分布不均利用电子显微镜检验可能造成假阴性，血清学检测法灵敏度偏低对含量较少病毒可能检测不出，指示植物症状判断法费时费力不能快速检测。基于核酸分子检测的反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription polymerase chain reaction，简称RT-PCR)具有灵敏度高、特异性强、准确性好等优点，RT-PCR已经成为病毒检测的一种常用方法，在病毒的检测上日益显示出强大的优势。

柑桔衰退病毒是正义单链RNA病毒(+ssRNA)，利用核酸分子检测需要首先将病毒RNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增(RT-PCR)。已经报道的常规柑桔衰退病毒核酸分子检测技术在制样技术、检测特异性以及检测体系优化等方面还存在一定的局限，还没有荧光定量RT-PCR对柑桔衰退病毒的检测技术报道。目前柑桔衰退病毒分子诊断试剂盒国内尚无生产、而进口的少量血清学试剂盒存在特异性差，影响到柑桔苗木柑桔衰退病毒的准确检出的问题。本发明拟通过特异性引物、探针筛选，内参对照、制样技术，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)反应体系优化等步骤，建立一种快速准确的一步法实时荧光定量RT-PCR分子检测技术平台及快速、简便、准确、高效的检测柑桔衰退病毒检测试剂盒，为柑桔衰退病毒有效检测提供有效工具。

发明内容

本发明旨在克服上述现有检测技术的不足，提供一种用于柑桔衰退病毒的一步法实时荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒及其检测方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

1、一种用于田间侵染的柑桔衰退病毒的一步法荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒，由以下各种检测试剂组成：

柑桔样品中病毒RNA提取试剂；

病毒RNA荧光定量RT-PCR固相化试剂；

无害化柑桔衰退病毒阳性对照品；

健康柑桔阴性对照品；

其关键是，所述样品中病毒RNA提取试剂是5mmol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.65％亚硫酸钠，在常温下的混合物；

2、所述无害化柑桔衰退病毒阳性对照品由如下步骤制得：

(1)提取含柑桔衰退病毒的总RNA，

(2)设计扩增柑桔衰退病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端带有T7启动子序列：5’-GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCATGTATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’，

下游引物序列为：5’-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’；

(3)进行RT-PCR扩增得柑桔衰退病毒DNA片段；

(4)以柑桔衰退病毒DNA片段为模板经体外转录得柑桔衰退病毒RNA片段用作无害化阳性对照。

所述病毒RNA荧光定量RT-PCR固相化试剂外观呈冻干胶珠；其中，固相化反应试剂含有如下组分：

组分                             终浓度

10×RT-PCR缓冲液                 1×，

25mM MgCl₂                       3mmo l/L，