[发明专利]一种抗氧化能力遗传风险评估的基因检测方法

摘要

本发明公开了一种抗氧化能力遗传风险评估的基因检测方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的CAT基因、CYBA基因、NOS3基因、SOD3基因、PON1基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供抗氧化能力的遗传风险评估、相关疾病风险规避的个性化健康指导。本发明的优点是在疾病发生之前，从遗传角度提示受检者与自由基相关的疾病发生风险，提高受检者的自我保健意识，积极采用合理的干预手段，达到降低疾病发生可能的目的；从分子机理角度分析疾病的致病因素以及发病机理，加深对疾病的认识，并可促进相应诊疗措施的制定，提高治疗效果。

主权项

1.一种抗氧化能力遗传风险评估的基因检测方法，其特征在于，其方法为：步骤1.检测的样品类型与采样方法：用采样拭在20-30个被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法：采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时-2.5小时，共抽提20-30个被测者样本，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3：荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入5个反应孔，同时检测5个位点，即过氧化氢酶(CAT)SEQ ID NO1：rs769214、还原型辅酶叶绿醇(CYBA)SEQ ID NO2：rs4673、内皮型一氧化氮合成酶(NOS3)SEQ ID NO3：rs1799983、胞外过氧化物岐化酶(SOD3)SEQ ID NO4：rs1799895和对氧磷酯酶1(PON1)SEQ ID NO5：rs6625个位点；20-30个被测者样本就有100-150个反应孔，并增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用-MGB技术，进行检测试剂合成；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABIMGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl₂溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、去离子水5.43μl、5个位点分别采用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC荧光探针(10μM，0.25μl)和FAM荧光探针(10μM，0.25μl)工具进行检测；将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟检测，经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将26个被测者样本检测5个点位的数据对号入座到5个图中，同时生成5张图，即过氧化氢酶(CAT)SEQ ID NO1：rs769214图、还原型辅酶叶绿醇(CYBA)SEQ ID NO2：rs4673图、内皮型一氧化氮合成酶(NOS3)SEQ ID NO3：rs1799983图、胞外过氧化物岐化酶(SOD3)SEQ ID NO4：rs1799895图、对氧磷酯酶1(PON1)SEQ ID NO5：rs662图；采用仪器为ABI7900型荧光定量PCR仪，检出率可达99％以上，可重复性达到100％。每小时可进行10000个SNP多态性终点检测分析，可满足从中通量到高通量的SNP多态性实验的需求；步骤4：SNP基因型分析将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的5个表和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、过氧化氢酶(CAT)SEQ ID NO1：rs769214在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X：0.4-0.5Y：0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X：0.3-0.4Y：1.0-1.3)区域为AA基因型、坐标轴(X：0.7-0.9Y：0.7-1.1)区域为AG基因型、坐标轴(X：0.7-0.8Y：0.3-0.4)区域为GG基因型，其中，AG、AA为风险基因型，携带风险基因型时过氧化氢酶表达减少，机体抗氧化能力下降；(2)、还原型辅酶叶绿醇(CYBA)SEQ ID NO2：rs4673在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X：0.4-0.5Y：0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X：0.3-0.4Y：1.0-1.3)区域为CC基因型、坐标轴(X：0.7-0.9Y：0.7-1.1)区域为TC基因型、坐标轴(X：0.7-0.8Y：0.3-0.4)区域为TT基因型，其中，CT、CC为风险基因型，携带风险基因型时还原型辅酶叶绿醇结合能力降低，机体抗氧化能力下降；(3)、内皮型一氧化氮合成酶(NOS3)SEQ ID NO3：rs1799983在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X：0.2-0.4Y：0.5-0.7)区域为空白对照、坐标轴(X：0.2-0.5Y：3.7-4.2)区域为GG基因型、坐标轴(X：1.7-1.9Y：3.5-3.7)区域为GT基因型、坐标轴(X：1.7-1.9Y：0.5-0.7)区域为TT基因型(该基因型在中国人群中频率很低，图330个样本中未检出该基因型)，其中，GT、TT为风险基因型，携带风险基因型时内皮型一氧化氮合成酶活性降低，降低了机体有益自由基生成；(4)、胞外过氧化物岐化酶(SOD3)SEQ ID NO4：rs1799895在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X：0.0-0.1Y：0.1-0.3)区域为空白对照、坐标轴(X：0.0-0.1Y：1.1-1.3)区域为CC基因型、坐标轴(X：0.2-0.3Y：0.9-1.2)区域为CG基因型、坐标轴(X：0.35-0.45Y：0.4-0.6)区域为GG基因型，其中，GG、CG为风险基因型，携带风险基因型时过氧化物岐化酶在体内的分布发生变化，罹患心脑血管疾病风险上升；(5)、对氧磷酯酶1(PON1)SEQ ID NO5：rs662在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X：0.0-0.1Y：0.1-0.3)区域为空白对照、坐标轴(X：0.0-0.1Y：1.4-1.6)区域为AA基因型(该基因型在中国人群中频率很低，上图30个样本中未检出该基因型)、坐标轴(X：0.7-0.9Y：1.4-1.6)区域为AG基因型、坐标轴(X：0.7-1.2Y：0.3-0.5)区域为GG基因型，其中，GG、AG为风险基因型，携带风险基因型时对氧磷酯酶1活性降低，加重了机体自由基损伤；每一个被测者的5个点落在5个表上哪个区域，即可知道被测者抗氧化能力的遗传风险。