[发明专利]一种高效检测体内蛋白相互作用的方法

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种高效检测体内蛋白相互作用的方法。本发明利用高效瞬时转染表达系统，改进生物素-链霉亲合素一步亲和纯化技术，应用只15个氨基酸的标签，整合同位素标记技术，建立了蛋白质相互作用检测方法。本方法采用用量为10⁷数量级的起始细胞，应用于原代细胞的蛋白质相互作用检测，特异性和效率明显高于现有技术，能鉴定出更多的相互作用蛋白尤其是弱的和瞬时相互作用，同时检测耗时和费用也大为减少。本发明有助于理解细胞的信号传导过程，对开发相关的对疾病有针对性治疗的药物及治疗方法具有重要参考价值。

主权项

1、一种高效检测体内蛋白相互作用的方法，其特征是采用用量为107数量级的起始细胞，检测原代细胞的蛋白质相互作用，包括下述步骤：1)构建质粒表达载体建立含有表达可生物素化的15个氨基酸的人工小肽段标签的通用质粒载体，构建含生物素化酶BirA基因的真核质粒表达载体；2)人工小肽段标签的可生物素化通过在细胞中共瞬时转染表达生物素化酶BirA基因实现与靶蛋白融合的肽段标签的生物素化；3)建立一步亲和纯化方法被生物素化的靶蛋白通过链霉亲合素磁珠富集纯化；4)整合氨基酸代谢标记技术与一步亲和纯化方法将细胞稳定同位素标记与可生物素化肽段标签一步亲和纯化技术整合；5)蛋白质酶解、质谱鉴定、数据库搜索和蛋白鉴定。