[发明专利]一种高效检测体内蛋白相互作用的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及蛋白质相互作用，具体涉及一种高效检测体内蛋白 相互作用的方法

背景技术

现有技术揭示了细胞的大部分生物学功能是通过多个蛋白质的相互作用来介导 的，虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是与其他 蛋白质形成复合物的形式来发挥作用的。细胞接受外源或是内源的信号(生理的、病理 的、以及药物等)，通过相应的信号传递途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特 性和发挥相应的生物学功能。在上述整个过程中，蛋白质之间的相互作用都参与其间， 并且随着时间和空间的变化而变化(1)。由于细胞中蛋白质的数量庞大，因此，在后基 因组时代，要更好地理解细胞的生物学活性、理解某些药物的作用机制，高通量的蛋 白质相互作用的检测就至关重要。蛋白质相互作用的研究将有助于理解细胞的信号传 导过程，对寻找和开发相关的对疾病进行有针对性治疗的药物和治疗方法都十分重要。

本领域公认，较为理想的用于检测蛋白质相互作用的方法，应该具有特异性并能 够尽量的反映蛋白质在生理状态下的相互作用，而且要高效，能适应高通量检测的需 求。但是目前的有关检测方法均难以满足上述需求，它们的主要缺陷表现为：起始细 胞用量巨大，特异性不高，耗时费力。

亲和纯化技术主要基于特异性抗体或与靶蛋白融合的标签肽段来富集靶蛋白及相 应的相互作用蛋白，而在此基础上发展的串联亲和纯化(tandem affinity purification，TAP)技术则串行两步的亲和纯化。该方法的优点是：1)不需要过多的 背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体，大量与靶蛋白相互作用的未知蛋白质可 鉴定出；2)蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平，是一种检测体内蛋白相互作 用的方法；3)TAP采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性(2)。但TAP技术尚存 在如下缺点：1)在哺乳动物细胞中天然表达的蛋白量很少，需要超大规模的培养细胞 (一般达到109数量级)才能获得用于质谱鉴定的蛋白量；2)多步洗涤的过程中弱的和瞬 时的相互作用复合物会丢失；3)标签肽段过大，可能妨碍靶蛋白与其它蛋白的相互作 用。为了在亲和纯化过程中获得更多的靶蛋白，Burckstummer等更改了传统的标签肽 段，分别用蛋白G和链霉亲合素结合肽(38个氨基酸)取代原来是双标签(3)。该方法可 使最初的细胞使用量减少至5×10⁷，但该方法仍然没有避免TAP技术的一些固有缺陷， 如标签肽段过大，仍需多步洗涤纯化等等。

为了简化纯化步骤，de Boer等建立了基于生物素-链霉亲合素系统的一步亲和纯 化方法(4)。此方法首先与靶蛋白融合了一个人工的可生物素化的小肽段标签(23个氨 基酸)，该标签可被在细胞中同时转染表达的生物素化酶BirA生物素化，被生物素化 的靶蛋白最终由链霉亲合素微珠结合富集。由于生物素-链霉亲合素之间的相互作用力 是目前已知的最强的存在于自然界中的非共价作用力，比抗体和通常使用的其它亲和 标签肽段高几个数量级，所以利用该系统可一步特异性的纯化靶蛋白及其相互作用蛋 白。

然而，建立在亲和纯化基础上的技术仍然会得到一些非特异性结合的蛋白，因此 如何将与靶蛋白特异性相互作用的蛋白区分开来同样变得十分重要。稳定同位素特征 标记生物质谱可以很好的解决这个问题。这一技术将不同质量的稳定同位素如碳¹³或 氮¹⁵或氘作为在DNA和蛋白质分子中特征质量标记引入生物质谱领域(5)。在蛋白质定 量研究中，将稳定同位素碳13或氮15标记的某种氨基酸作为标记载体加入细胞培养 液中，由此所产生的细胞中的蛋白质群体会在相应氨基酸序列的位置包含这些比自然 氨基酸更重的标记载体，从而在质谱上很容易被区分开来，该技术被称为氨基酸代谢 标记(amino acid-coded mass tagging，AACT)技术(6，7)，或者SILAC(stable isotope labeling by amino acids in cell culture)技术(8)。