[发明专利]一种高效检测体内蛋白相互作用的方法

权利要求书

1.一种检测体内蛋白相互作用的方法，其特征是采用用量为10⁷数量级的HEK239T 细胞，整合氨基酸代谢标记技术与一步亲和纯化方法，检测细胞的蛋白质相互作用， 包括下述步骤：

（1）构建质粒表达载体

1）以含有表达可生物素化的16个氨基酸的人工小肽段标签的通用质粒载体，构 建同时含14-3-3ε的质粒pAP-N-1433；

所述的16个氨基酸其对应的DNA序列为：

TCCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA；

所述的通用质粒载体基于pcDNA3.1Directional TOPO载体，所述载体有两个亚型， 分别用于将肽段标签连于靶蛋白的N端和C端，分别命名为pAP-N和pAP-C；

所述的14-3-3ε为HEK239T细胞的接头蛋白；

2）构建含生物素化酶BirA基因的真核质粒表达载体pBirA；所述的BirA基因 具有序列1的序列；

（2）稳定同位素的氨基酸代谢标记，细胞培养过程中实现；

（3）人工小肽段标签的可生物素化

通过在细胞中共瞬时转染pBirA和pAP-N-1433质粒，表达生物素化酶BirA基因 实现对靶蛋白融合的肽段标签的生物素化，包括步骤：

293T细胞用AACT技术标记并培养在含10%透析胎牛血清、带标记氨基酸的 DMEM培养液中，标记为293T-d3；同时未标记的293T细胞用10%透析胎牛血清普通 DMEM培养液培养，标记为293T-d0；293T-d3细胞转染pAP-N-1433，293T-d0细胞转 染pBirA和pAP-N-1433；转染40小时后，裂解细胞后获得总蛋白；

（4）建立一步亲和纯化方法

被生物素化的靶蛋白通过链霉亲和素磁珠富集纯化；

（5）蛋白质酶解、质谱鉴定、数据库搜索和蛋白鉴定。