[发明专利]戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明是一种涉及生物工程领域的检测方法，特别是用于定量检测临床标本中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)滴度的荧光定量PCR检测方法。本发明包括如下步骤：病毒特异性定量PCR引物和探针设计；标准分子的构建；病毒样本RNA的提取；样本RNA的cDNA合成；荧光定量PCR检测方法的建立和优化。本发明的检测灵敏度可达10°数量级的病毒拷贝，具有良好的稳定性和特异性，可用于大批量的样本检测，并可对样本的病毒载量进行准确定量。

主权项

1.一种戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征在于检测方法步骤如下：(1).病毒特异性定量PCR引物和探针设计，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，在Genbank中检索戊型肝炎病毒全序列，通过生物信息学比对分析，选取序列保守片段，应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一对PCR引物和Taqman探针，探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA，引物和探针位于戊型肝炎病毒ORF2区域，目的扩增片段为151bp，扩增序列为：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCT引物和探针序列为：上游引物：HEV-1(+)：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT； 下游引物：HEV-2(-)：AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG；Taqman探针序列：5’-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3’；(2).定量标准品的构建根据确定的PCR引物，利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体pET-28a中，构建的重组质粒pET28a-ORF2作为检测戊型肝炎病毒滴度的定量标准品；(3).样本中戊型肝炎病毒的分离及其RNA的提取，并针对病毒含量较低的样本用聚乙二醇和氯化钠进行浓缩，提高检测的灵敏度；(4).对提取的样本RNA进行逆转录反应，获得样本cDNA；(5).定量检测方法的优化和建立通过筛选不同的Mg2+浓度、引物浓度、Taqman探针浓度，选择具有高灵敏度、合适反应效率的反应体系和反应条件。并通过对反应体系的灵敏度、稳定性和特异性等指标对建立的荧光定量PCR方法进行综合评价；(6).经过对临床标本的检测进行应用评估，验证建立的荧光定量PCR的可靠性。