[发明专利]戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征在于检测方法步骤如下：

(1).病毒特异性定量PCR引物和探针设计，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，在Genbank中检索戊型肝炎病毒全序列，通过生物信息学比对分析，选取序列保守片段，应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一对PCR引物和Taqman探针，探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA，引物和探针位于戊型肝炎病毒ORF2区域，目的扩增片段为151bp，扩增序列为：

GAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCT

引物和探针序列为：

上游引物：HEV-1(+)：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT；    

下游引物：HEV-2(-)：AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG；

Taqman探针序列：5’-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3’；

(2).定量标准品的构建

根据确定的PCR引物，利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体pET-28a中，构建的重组质粒pET28a-ORF2作为检测戊型肝炎病毒滴度的定量标准品；

(3).样本中戊型肝炎病毒的分离及其RNA的提取，并针对病毒含量较低的样本用聚乙二醇和氯化钠进行浓缩，提高检测的灵敏度；

(4).对提取的样本RNA进行逆转录反应，获得样本cDNA；

(5).定量检测方法的优化和建立

通过筛选不同的Mg²⁺浓度、引物浓度、Taqman探针浓度，选择具有高灵敏度、合适反应效率的反应体系和反应条件。并通过对反应体系的灵敏度、稳定性和特异性等指标对建立的荧光定量PCR方法进行综合评价；

(6).经过对临床标本的检测进行应用评估，验证建立的荧光定量PCR的可靠性。

2.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，

其特征在于标准阳性模板核苷酸序列为：

GAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCT

3.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征是所述的病毒特异性定量探针，指的是长度为21 bp的寡聚核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征是所述的探针序列为CCGCATGACATCGACCTCGGG。

5.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征是所述的探针5’端标记的荧光报告基团是FAM。

6.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，其特征是所述的3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。