[发明专利]戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明是一种涉及生物工程领域的检测方法，特别是用于定量检测临床标本中戊型肝炎病毒滴度的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)引起的一种急性、自限性疾病。病毒主要通过粪-口途径传播，广泛流行于发展中国家，主要侵犯青壮年，孕妇感染后死亡率可达20％以上，构成严重的公共卫生问题。我国为戊型肝炎的高发区，控制该病刻不容缓。目前，对戊型肝炎的诊断除临床症状外，通常采用ELISA法检测血清中抗HEV-IgG抗体。但是，目前ELISA检测灵敏度及特异性较低，漏检率高，给戊型肝炎的诊治带来困难。而实时荧光定量PCR作为一种新的技术已经广泛应用于疾病诊断，因此迫切需要建立一种灵敏、稳定、特异性强的荧光定量PCR方法，用于戊型肝炎的临床诊断及HEV定量检测。建立该方法将为戊型肝炎的早期诊断，病程中粪便和血清中病毒载量的消长规律、抗病毒药物筛选、感染动物模型的研究提供方法；为戊肝的抗病毒治疗效果的评价提供技术平台；为戊型肝炎的流行病学监测、致病机理的研究提供技术支持；还可用于监测戊型肝炎流行区水体的HEV污染状况，以及食品及生物制品的HEV检测，进一步提高我国的戊型肝炎防治水平。

荧光定量PCR技术具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、无污染、实时和准确等特点，已经广泛应用于病原体检测、单核苷酸多态性(SNP)测定及突变分析、基因表达分析、肿瘤基因检测等方面的研究。在病毒检测方面，它不仅能对病毒定性，更能快速、准确地定量病毒核酸，使研究病毒负荷和疾病进展的关系成为可能，从而可以动态地研究在整个病程中病毒载量的消长规律，并可对抗病毒治疗的效果和耐药变异毒株的出现作出评估，为抗病毒药物的筛选以及研究工作提供有效的技术平台。目前，在国内外荧光定量PCR技术广泛应用于疾病的临床诊断，定量检测乙型肝炎病毒、艾滋病病毒、巨细胞病毒、结核杆菌等各种病原体的商品化试剂盒已经面世，但是尚无HEV荧光定量PCR试剂盒问世。

戊型肝炎的实验室诊断常用酶联免疫法检测血清抗HEV-IgG和IgM，逆转录PCR方法检测粪便和血清中病毒RNA。但是，ELISA检测戊型肝炎特异性抗体的敏感度有限，而且所用抗原不尽相同，导致检出率差异较大，随着人们发现的HEV基因型的日益增多，需要合成更多的抗原检测试剂，以降低漏检率。而由于临床样本中的病毒含量非常低，常规RT-PCR方法灵敏度不够，易产生漏检。本发明采用绝对定量技术，建立灵敏、稳定、特异性强的荧光定量PCR检测HEV的方法，适用于戊型肝炎的临床诊断。

荧光PCR定量检测HEV方法的建立，将给戊型肝炎的诊断技术带来巨大飞跃；为抗病毒药物筛选、感染动物模型、患者发病过程中粪便和血清中病毒载量消长规律等方面的研究提供方法；为戊肝的抗病毒治疗效果的评价提供技术平台；为戊型肝炎的流行病学监测、致病机理的研究提供技术支持；还可用于监测戊型肝炎流行区水体的HEV污染状况，以及食品及生物制品的HEV检测，进一步提高我国的戊型肝炎防治水平。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种HEV病毒的荧光定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度可达10⁰数量级，较传统的RT-PCR和RT-nPCR方法具有更高的灵敏度，且操作简便，可进行大批量的样本分析，并对HEV进行定量，从而为戊型肝炎病毒的检测和监控提供有效方法。

本发明通过对Genbank中HEV全序列进行生物信息学分析，选取HEVORF2基因的保守区段为靶目标，应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一对PCR引物和Taqman探针。本发明所述的HEV特异性定量检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为151bp。

引物和探针序列为：

上游引物：HEV-1(+)：GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT；

下游引物：HEV-2(-)：AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG；

Taqman探针序列：5’-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3’。

本发明包括如下步骤：

1.通过生物信息学分析，选择HEV ORF2基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

GAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTA