[发明专利]利用分子标记累加高色素基因hp1和hp2的番茄育种方法

摘要

利用分子标记累加高色素基因hp1和hp2的番茄育种方法是通过筛选出对hp1、hp2基因以及显性等位基因Hp1和Hp2具有高度特异性的分子标记，以它们的分子标记为依据，可以准确地确定杂交后代单株中是否含有hp1和hp2以及hp基因的结合状态，从而筛选出同时含有hp1和hp2的单株，在短时间内实现这2个基因的聚合和纯化，进而选育出番茄红素含量大幅度提高的番茄新品种。该技术体系即等位基因特异性PCR技术具有特异性高、重复性好以及费用低廉等优点。应用植物的分子育种可以加速育种世代，节约时间和人力。具有很好的实际应用效果。

主权项

1.一种利用分子标记累加高色素基因hp1和hp2的番茄育种方法，其特征在于：通过如下的技术方案来实现：(1)隐性突变基因hp1和显性等位基因Hp1特异性分子标记的筛选：从GenBank--http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank中搜索到hp1的cDNA序列编号为AY531660、DNA序列编号为AY531661，比较突变基因hp1和对应等位基因Hp1的DNA序列，发现在功能表达区的11090位点，发生了T和A的置换，隐性突变基因hp1在11090位置为T，野生型等位基因Hp1在11090位置是A；以突变位点T为目标设计上游引物，把T放在上游引物5`端的不同位置，突变位点分别位于上游引物的第一及倒数第一和第五位，并分别命名为hp11090、11090(1)、11090(5)，如表1所示，利用公用的引物设计软件Primer3--http://www-genome.wi.mit.edu；设计下游引物，获得下游引物的序列为tcaggctggagattgagct--命名为hp11337right；用这个下游引物和不同的上游引物配对进行聚合酶链式反应PCR，经过反复的试验和比较，最后成功地筛选出了对突变位点T具有高度专化性的上游引物及其配套的反应条件；番茄红素hp1基因SNP的引物其中：*为突变位点；设计的三个上游引物中11090(1)11090(5)两个引物在多次试验中扩增出了目的条带，产物大小为264bp，反应的退火温度为53.5℃，高于此温度无扩增产物，低于该温度则对突变体和野生型没有特异性，如下所示；因此，上游引物突变位点位于倒数第1和第5的引物能扩增出目的条带，能有效地区分出突变体和野生型的番茄植株；11090(1)11090(5)两引物在不同退火温度下PCR结果其中：+表示有扩增产物，-表示无扩增产物，-/+表示扩增产物不稳定；Hp1特异性引物的筛选：用同样的方法设计对野生型基因位点特异的引物，将发生突变的位点设计在位于上游引物的倒数第五位ccatatcatacctagactatgc并命名为hp1w5；下游引物为：caccaccagaaataggcaact并命名为Hp1-194；对扩增条件进行优化和筛选最终摸索出最适的退火温度为59.5度，如下；扩增产物的大小为194bp；hp1w5-Hp1-194对引物在不同退火温度下PCR结果其中：+表示有扩增产物，-表示无扩增产物；(2)隐性突变基因hp2和显性等位基因Hp2特异性分子标记的筛选Hp2基因定位在第一染色体上，是去黄化基因(DET1)的同源基因；从GenBank中搜索到hp2的DNA序列编号为AJ224356和AJ224357，比较突变基因hp2和对应等位基因Hp2的DNA序列，发现在功能表达区的8510处位点，发生了T和A的置换，隐性突变基因hp2在8510位置为T，野生型等位基因Hp2在8510位置是A；根据上述hp1突变位点标记的方法，以突变位点T为目标设计上游引物，把T放在上游引物5`端的不同位置，利用公用的引物设计软件Primer3设计下游引物，获得下游引物的序列，如下：番茄红素hp2基因SNP的引物其中：*为突变位点；与hp1基因SNP的检测结果类似，设计的三个上游引物中hp(1)和hp(5)两个引物在多次试验中扩增出目的条带，产物大小为334bp，反应的退火温度为49℃，高于此温度无扩增产物，低于该温度则对突变体和野生型没有特异性，如下；上游引物突变位点位于倒数第1和第5的引物匀能扩增也目的条带，能有效地区分出突变体和野生型的番茄植株；hp(5)与共同引物扩增产物的PCR电泳图；hp(1)1hp(5)在不同退火温度下PCR结果注：+表示有扩增产物，-表示无扩增产物；采用相同原理，筛选出对Hp2具有特异性的分子标记，其分子量为390bp，退火温度为53℃；(3)把hp1和hp2聚合在同一个基因型中的技术路线A、以hp1和hp2的分子标记为依据进行回交转育：用分别含有纯合hp1和纯合hp2的自交系相互杂交，获得同时含有hp1和hp2的F1杂交种，以该杂交种为供体、以农艺性状优良的自交系P为受体杂交，后代中分离出4种基因型，即(+/+，+/+)、(+/hp1，+/+)、(+/+，+/hp2)、(+/hp1，+/hp2)；用hp1和hp2的分子标记进行检测，同时出现这2个基因分子标记的个体必然是目标基因型(+/hp1，+/hp2)；以该基因型为母本，用受体自交系为父本进行回交，回交后代也会出现4种基因型，其中目标基因型(+/hp1，+/hp2)可以用hp1和hp2的分子标记检测出来；再以该基因型为母本进行回交和分子标记筛选，如此连续进行3-4次，即可得到农艺性状与受体自交系P基本相同、但同时含有hp1和hp2的基因型P(+/hp1，+/hp2)；B、以Hp1和Hp2的分子标记为依据，从自交后代中剔除杂合基因型：根据独立分配定律，P(+/hp1，+/hp2)的自交后代分离出9种基因型，首先利用hp1和hp2特有的分子标记把同时含有这2个基因的4种基因型筛选出来，它们的遗传构成及其在分离后代的比例为：1/4(+/hp1，+/hp2)，1/8(hp1/hp1，+/hp2)，1/8(+/hp1，hp2/hp2)，1/16(hp1/hp1，hp2/hp2)；这4种基因型在分离后代中所占的总比例为9/16，也就是利用hp1和hp2的分子标记可以有50％以上的机会筛选出目标基因型；在这4种基因型中，以Hp1的分子标记为依据，把基因型(+/hp1，+/hp2)和(+/hp1，hp2/hp2)筛选出来，再以Hp2的分子标记为依据，从剩下的群体中把基因型(+/hp1，hp2/hp2)剔除，最后留下来的个体应是目标基因型(hp1/hp1，hp2/hp2)；目标基因型含有2个纯合的高色素基因hp1和hp2，它可以作为供体自交系为其它自交系的改良提供高色素基因源；其技术路线：注：P代表番茄自交系，(hp1/hp1)代表含有纯合hp1基因的亲本，代表入选的单株。