[发明专利]基因启动子甲基化的检测方法

摘要

本发明基因启动子甲基化的检测方法，解决了目前甲基化检测难于重复、亚硫酸氢钠修饰、多启动子甲基化多重甲基化特异PCR扩增、低扩增效率和MSP反应等问题。具体为：首先用提取的DNA用新鲜配制修饰试剂进行修饰，过柱后纯化脱硫反应，用无水乙醇和鲑鱼精子DNA富集微量的修饰后的DNA，进一步选用特定的PCR GC Buffer进行多重甲基化特异PCR扩增多对基因启动子引物指导的DNA模板，然后电泳分析结果。本发明具有灵敏、准确、稳定、特异性等特点，降低了检测成本，为甲基化的研究提供了新的方法。

主权项

1.基因启动子甲基化的检测方法，具体步骤如下：(1).亚硫酸氢钠修饰a.配制试剂：用对苯二酚溶于ddH2O中配制10mmol/L的对苯二酚溶液；用亚硫酸氢钠溶于水中，用氢氧化钠调pH值，以配制3.9mol/L、pH值为5.0的亚硫酸氢钠溶液；b.修饰过程：取1μgDNA，加ddH2O至50μl，加入3mol/L的NaOH溶液5.5μl，54℃放20min变性。向已变性的DNA中加入30μl10mmol/L的对苯二酚溶液和520μl 3.9mol/L，54℃保温16h；然后用纯化柱纯化，纯化后的DNA加入50μl、预温80℃的ddH2O溶解，并加入3mol/L的NaOH溶液5.5μl，25℃放置15min，加入56μl的3mol/L的NH4Ac室温静止10min，修饰的DNA用2.5倍体积预冷无水乙醇和1μl 5mg/ml的糖原沉淀DNA，-40℃过夜。次日再用70％酒精洗涤沉淀2次，干燥后用30μlTE溶解，-40℃保存备用。当200ngDNA样品较少时，在纯化回收时可加入适量鲑鱼精DNA作为载体，有利于DNA沉淀；(2).引物设计：模板DNA在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点5/-端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的Cp6岛内CpG位点5/-端胞嘧啶转化为尿嘧啶；针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物，进行PCR扩增；设计好的引物要用引物软件如Primer6.0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率低于40％的引物要进行优化，方法是：在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。(3).MSP(甲基化特异性聚合酶链)反应：经过修饰后的模板DNA为单链状态，MSP的DNA模板在抽提后纯度要求A260/A280在1.8～2.0之间，Mg2+浓度一般在2.0mmol/L；选用针对富含CG等复杂二级结构模板的GC Buffer，扩增通用条件：95℃预变性5分钟，95℃60秒，60℃60秒，72℃60秒，35个循环(对于血清样品等提取的微量DNA选用50个循环)，最后1个循环70℃延伸5分钟。然后在2.5％琼脂糖凝胶电泳上溴化乙锭染色后观测基因启动子甲基化结果。