[发明专利]酶法水解蛋白制备磷酸肽和非磷酸肽的方法

摘要

本发明公开了一种酶法水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽的方法，主要以酪蛋白为原料，采用单一碱性蛋白酶Alcalase2.4L进行控制水解，采用三硝基苯磺酸法监控DH值，用乙醇—钙分离法从酪蛋白水解液中同时制备CPP和CNPP。CPP的氮/磷摩尔比为20～25比1，得率35％以上；CNPP得率达到45％；鉴定出CNPP产品中两种ACE抑制活性肽和一种抗氧化活性肽的氨基酸序列为Tyr－Leu、Glu－Asp－Val－Pro和His－Ser。本发明酶水解效果好，价格适宜，工艺路线合理，原料利用率高，易于放大，产品CPP和CNPP可广泛应用于功能性食品配料和保健食品。

主权项

1、一种酶法水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽的方法，以酪蛋白为原料，采用单一碱性蛋白酶Alcasase2.4L进行控制水解，采用三硝基苯磺酸法监控DH值，然后采用乙醇-钙分离法从酪蛋白水解液中同时制备酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽，工艺为：(1)溶解：在55～65℃下，将酪蛋白溶解在PH8.0～9.0的碱溶液中，配成质量浓度16％～20％的酪蛋白溶液；(2)酶解：按1～1.5mL酶液/100g酪蛋白的比例加入Alcalase2.4L，在55～65℃下搅拌2～4h，取样，采用三硝基苯磺酸法监控DH值达到15～20，然后升温灭酶；(3)乙醇-钙沉淀：加入氯化钙质量/水解液体积比1.2％的氯化钙，再加入食用级乙醇终浓度70％～80％，搅拌30min，30℃以下静置过夜；或3000rpm离心20min分层；(4)酪蛋白磷酸肽产品的获得：虹吸出上层清液，底部的沉淀部分3000rpm、15min离心，沉淀部分在45℃以下真空干燥得到酪蛋白磷酸肽粉末产品，产品水分含量在4.5％以下；将上清液合并，为酪蛋白非磷酸肽部分；(5)酪蛋白非磷酸肽的纳滤浓缩与乙醇回收：对(4)的酪蛋白非磷酸肽部分以截留相对分子质量为300D的纳滤膜进行纳滤，得到酪蛋白非磷酸肽纳滤浓缩液和回收乙醇；(6)大孔吸附树脂脱盐：浓缩所得60～150mg/ml浓度的酪蛋白非磷酸肽以每小时1个床体积的流速上样至DA201-C大孔吸附树脂柱，水洗后用70％乙醇解吸；(7)喷雾干燥：进出风温度分别为160～180℃和70～80℃，喷雾干燥得到酪蛋白非磷酸肽粉末；(8)酪蛋白非磷酸肽中ACE抑制活性肽和抗氧化活性肽的结构鉴定：依次利用体积排阴色谱SephadexG-25、离子交换色谱DTF-02、大孔吸附树脂色谱DA201-C和半制备型RP-HPLC从酪蛋白非磷酸肽中分离得到两种抑制ACE活性肽和一种抗氧化活性肽；再采用SE-HPLC、LC/MS以及氨基酸分析证明这三种肽的氨基酸序列分别为Tyr-Leu、Glu-Asp-Val-Pro和His-Ser。