[发明专利]酶法水解蛋白制备磷酸肽和非磷酸肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于乳制品开发和功能性保健食品技术领域，涉及一种酶法水解酪蛋白制备磷酸肽(CPP)和非磷酸肽(CNPP)的方法。

背景技术

近年来，人类钙营养不足的问题受到了广泛的关注。全世界，尤其是发展中国家，钙缺乏早已是普遍现象，其中最严重的是孕妇、儿童和老年人。我国正常人钙的推荐量为800mg/d，但是营养调查结果显示人均钙摄入量仅为400mg/d，而儿童和孕妇实际摄入量还不到应摄入量的一半。我国老年人骨质疏松症发病率达到30％-50％，儿童佝偻病发病率高达20％-50％。目前有研究表明，膳食中摄入充足的钙可以减少高血压的发病率。因此，钙对不同年龄和性别的人群都很重要。影响人体钙吸收的因素很多，除人体自身有吸收障碍问题外，更重要的是我国的膳食结构是以植物性食品为主，动物性食品为辅的温饱型膳食类型，这种膳食类型会造成人体摄入钙不足。人们一定要注意科学补钙，CPP是当之无愧的科学补钙桥梁。此外，CPP同样可以结合其它金属元素并促成它们被人体吸收，这更加增添了人们对CPP研究和开发的兴趣。

高血压是一种高发病率、高并发症、高致残率的严重影响人体健康的“无声杀手”。统计表明，发达国家高血压患病率在20％以上，面其它国家的发病率也在10％～20％。全世界每年的高血压病死亡率达1200万。对于高血压的治疗，目前存在以下错误：(1)对高血压的危害认识不够，不做治疗控制；(2)只单纯降血压，不综合治疗各种危险因素；(3)一发现高血压就进行药物治疗，而不做非药物治疗。研究表明，源于食物蛋白质的降血压肽完全可以克服药物治疗中出现的种种副作用，它只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者却无降压作用，同时它还有免疫调节作用。进一步开发天然降血压肽产品是大势所趋，它将成为非药物治疗中的重要组成部分。

酪蛋白中富含多种生物活性肽，其中CPP是被研究和开发最早的一种，具有结合矿物质(如钙)的作用。CNPP作为一种天然存在且同时具有潜在抗氧化活性和抑制ACE活性的物质，对高血压等疾病起到防治效果，无病人群食用可以有预防保健作用，有病人群食用起到非药物治疗的作用。因此，采用酪蛋白为原料制备生物活性肽已经成为当前的研究热点。

目前，研究者报道了酪蛋白源的ACE抑制肽的分离纯化，但未对其功能性组分的结构予以阐明；研究者还利用包括胰酶、碱性蛋白酶在内酶解与膜滤集成工艺连续制备酪蛋白生物活性多肽，但其所用酶类种类多、价格贵(CN1546682)；另外有研究者以牛乳酪蛋白为原料、采用蛋白酶水解、离子交换树脂脱盐生产由六肽至十一肽组成的ACE抑制肽(CN1552891)，但其工艺路线较复杂，冷冻干燥使得成本不菲；还有研究者采用复合蛋白酶酶解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽(CPP)，但未利用CNPP。

因此，采用价格适宜的蛋白酶水解酪蛋白制备CPP和CNPP，充分提高原料利用率，既具有很大的经济效益，也具有一定的社会效益。而选择合适的脱盐方式降低多肽产品中的盐类，以CPP和CNPP产品的推广利用具有重要的意义。同时，对于CNPP产品中具有功能性质的重要多肽也有必要鉴定其结构，便于深入研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶法水解酪蛋白同时制备酪蛋白磷酸肽(CPP)和酪蛋白非磷酸肽(CNPP)的方法。

本发明的技术方案为：以酪蛋白为原料，采用单一碱性蛋白酶Alcalase2.4L进行控制水解，采用三硝基苯磺酸法监控DH值，然后采用乙醇-钙沉淀法从酪蛋白水解液中分离CPP和CNPP，同时制备酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽，CPP的部分采用真空干燥得到CPP粉末产品，得率35％以上。CNPP部分采用纳滤浓缩，回收乙醇，采用大孔吸附树脂脱盐，然后采用喷雾干燥得到CNPP粉末产品中，得率45％以上。对CNPP产品中两种ACE抑制活性肽和一种抗氧化活性肽予以鉴定，得到其氨基酸序列。工艺为：

(1)溶解：在55～65℃条件下，将酪蛋白溶解在PH为8.0～9.0的碱溶液中，配成质量浓度16％～20％(m/m)的酪蛋白溶液。

(2)酶解：按1～1.5mL酶液/100g酪蛋白的比例加入Alcalase2.4L，在55～65℃的温度下搅拌2～4h，取样，采用三硝基苯磺酸(TNBS)法监控DH值达到15～20，然后升温至80～85℃，保温15min灭酶。

(3)乙醇-钙沉淀：加入1.2％(氯化钙质量/水解液体积)的氯化钙，再加入食用级乙醇至乙醇终浓度70％～80％，搅拌30min，静置过夜，时间在6小时以上，温度在30℃以下；静置分层的方法也可以由3000rpm离心20min替代。