[发明专利]使用高通量测序技术对复杂基因组测序的改良策略

摘要

测定基因组序列的一种方法，其包含下述步骤：使用至少一个第一限制性核酸内切酶消化基因组，把至少一个接头连接到第一亚集的限制性片段上，使用第一引物组合选择性扩增接头连接的限制性片段的第一集合，其中第一引物在引物序列的3′末端含有具有1－10个选择性核苷酸的第一选择的序列，使用至少第二引物组合重复这些步骤，其中第二引物组合的引物含有不同的第二选择性序列，片段化扩增的接头连接的限制性片段的每一个亚集以产生测序库并确定片段的核苷酸序列，比对每个库中的片段序列以产生连接片段，对于第二和/或进一步的限制性核酸内切酶重复这些步骤，比对从每个第二和/或进一步的限制性核酸内切酶所获得的重叠群以提供基因组的序列。

主权项

1. 测定基因组序列的方法，其包含下述步骤：(a)通过使用至少一种第一限制性核酸内切酶消化基因组提供限制性片段以提供基因组第一亚集；(b)连接至少一个接头到第一亚集的限制性片段，以提供接头连接的限制性片段的第一集合；(c)为了提供扩增的接头连接的限制性片段的第一亚集，使用第一引物组合选择性地扩增接头连接的限制性片段的第一集合，其中至少第一引物含有互补于接头和互补于限制性核酸内切酶识别序列一部分的片段，进一步在引物序列3′末端包含第一选择性的序列，其中第一选择序列含有1-10个选择性核苷酸；(d)为了提供扩增的接头连接的限制性片段的第二和/或进一步的亚集，使用至少第二和/或进一步引物组合重复步骤(c)，其中引物在它的3′末端，含有不同的第二和/或进一步的选择的序列；含有相同的选择性核苷酸数量；(e)为了产生第一、第二和/或进一步的测序文库，片段化每个扩增的接头连接的限制性片段的第一、第二和/或进一步的亚集，随后进行文库的选择性汇集；(f)确定包含在每个第一、第二和/或进一步的文库中的(至少部分)片段的(至少部分的)核苷酸序列；(g)对每个第一、第二和/或进一步的文库中的片段的序列进行比对，以产生扩增的接头连接的限制性片段的重叠群，所述扩增的接头连接的限制性片段来源于代表基因组的分散的级分；(h)用至少一个第二和/或进一步的限制性核酸内切酶重复步骤(a)-(g)；(i)为了提供基因组的序列，对于每个第二和/或进一步的限制性核酸内切酶，对在步骤(g)和(h)中获得的重叠群进行比对。