[发明专利]使用高通量测序技术对复杂基因组测序的改良策略

权利要求书

1. 测定基因组序列的方法，其包含下述步骤：

(a)通过使用至少一种第一限制性核酸内切酶消化基因组提供限制性片段以提供基因组第一亚集；

(b)连接至少一个接头到第一亚集的限制性片段，以提供接头连接的限制性片段的第一集合；

(c)为了提供扩增的接头连接的限制性片段的第一亚集，使用第一引物组合选择性地扩增接头连接的限制性片段的第一集合，其中至少第一引物含有互补于接头和互补于限制性核酸内切酶识别序列一部分的片段，进一步在引物序列3′末端包含第一选择性的序列，其中第一选择序列含有1-10个选择性核苷酸；

(d)为了提供扩增的接头连接的限制性片段的第二和/或进一步的亚集，使用至少第二和/或进一步引物组合重复步骤(c)，其中引物在它的3′末端，含有不同的第二和/或进一步的选择的序列；含有相同的选择性核苷酸数量；

(e)为了产生第一、第二和/或进一步的测序文库，片段化每个扩增的接头连接的限制性片段的第一、第二和/或进一步的亚集，随后进行文库的选择性汇集；

(f)确定包含在每个第一、第二和/或进一步的文库中的(至少部分)片段的(至少部分的)核苷酸序列；

(g)对每个第一、第二和/或进一步的文库中的片段的序列进行比对，以产生扩增的接头连接的限制性片段的重叠群，所述扩增的接头连接的限制性片段来源于代表基因组的分散的级分；

(h)用至少一个第二和/或进一步的限制性核酸内切酶重复步骤(a)-(g)；

(i)为了提供基因组的序列，对于每个第二和/或进一步的限制性核酸内切酶，对在步骤(g)和(h)中获得的重叠群进行比对。

2. 根据权利要求1的方法，其中第一、第二和/或进一步的限制性核酸内切酶中的至少一个是罕见内切酶。

3. 根据权利要求1或2的方法，其中第一、第二和/或进一步的限制性核酸内切酶中的至少一个是常用内切酶。

4. 根据权利要求1、2或3的方法，其中至少使用2个罕见内切酶。

5. 根据权利要求1-4的方法，其中使用一个罕见内切酶和一个常用内切酶。

6. 根据权利要求1-5的方法，其中扩增方法为PCR，优选地为Lone-Range PCR。

7. 根据权利要求1-6的方法，其中引物3′末端的选择的序列含有1-8个选择的核苷酸，优选地1-5个，更优选地1-3个。

8. 根据权利要求1-7的方法，其中位于引物3′末端的第一、第二和进一步的选择性序列具有相同的核苷酸数量，但是选择性序列的核苷酸序列彼此互不相同。

9. 根据权利要求1-8的方法，其中通过Sanger双脱氧测序法进行测序。

10. 根据权利要求1-8的方法，其中测序是在固相支持物例如珠子上进行的。

11. 根据权利要求1-8的方法，其中测序是基于高通量测序，优选地是合成测序。

12. 根据权利要求1-8的方法，其中测序是基于合成测序，优选地是焦磷酸测序。

13. 根据权利要求1-8的方法，其中测序包含下述步骤：

(f1)把测序接头连接到片段上；

(f2)退火测序接头连接的片段到珠子上，每个珠子与单个片段退火；

(f3)乳化油包水微反应器中的珠子，每个油包水微反应器包含单个珠子；

(f4)在珠子表面进行乳化PCR以扩增接头连接的片段；

(f5)挑选/富集含有扩增的接头连接的片段的珠子；

(f6)把珠子加载于孔中，每个孔含有单个珠子；

(f7)产生焦磷酸信号。

14. 根据前述权利要求的任一项的方法，其中重叠群的建立进一步通过使用来自于其它资源的核苷酸测序来辅助，所述其它资源包括，但并不局限于BAC末端序列、BAC鸟枪序列、EST序列或完整基因组鸟枪序列。

15. 根据前述权利要求的任一项的方法，其中通过使用限制性核酸内切酶消化基因组制备基因组亚集以提供限制性片段，随后进行非选择性扩增。

16. 根据前述权利要求的任一项的方法，其中降低混合物复杂性的方法是基于直接针对于保守基序的索引连接器、CHIP或PCR引物。