[发明专利]猪瘟病毒荧光定量RT－PCR诊断试剂盒

摘要

本发明属兽用生物制品技术领域。本发明公开了一种动物传染病猪瘟诊断试剂盒。该试剂盒是以本发明人所设计并筛选出的猪瘟病毒荧光探针和引物建立起荧光RT－PCR反应体系用于猪瘟病毒的诊断和猪瘟活疫苗生产过程中的中间监测。本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、线性关系好、操作简单、没有后处理过程，有很高的使用价值。

主权项

1 一种猪瘟病毒诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒是由试剂、对照品和水所组成：1)阳性和弱阳性对照：采用猪瘟病毒石门标准毒株特异克隆片段体外逆转录获得特异RNA，含量为0.126～0.368μg/10μl和0.013～0.037μg/10μl，300μl/管分装，各2管，-20℃冻存备用；2)阴性对照：采用SPF猪各组织，按1∶5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，然后3000r/min离心10min，取上清液转入离心管中，分装成1200μl/管，共10管，-20℃冻存备用；3)0.1％焦碳酸二乙酯水：在去离子水中加入0.1％焦碳酸二乙酯，37℃1小时处理，或室温过夜处理，15磅高压20分钟，20ml/瓶；4)Trizol裂解液：25ml/瓶，分装至棕色瓶中，4℃存放备用；5)RT-PCR反应液：每个反应包括10×PCR buffer 5μl、dNTP 1μl、J1 2.5μl、J2 2.5μl，共11.0μl，50个反应共计550μl，分装成2管，每管275μl；J1和J2为本发明设计、由上海基康生物技术有限公司合成的引物J1：5’-GAGTCCAGGAACCGGAATACGAT-3’和J2：5’-TCCGGCTATCATGTCGTAGCTT-3’；6)反应酶：每个反应包括StrataScript反转录酶0.3μl、Taq DNA聚合酶1.0μl，共1.3μl，50个反应共计65μl，分装成1管；7)探针溶液：按本发明所设计的探针T1：5’-TGCGTGTACCTCACTCCCGTCTCGAAA-3’，由5’-FAM，3’-TAMRA修饰，合成的探针用0.1％焦碳酸二乙酯水稀释成5μM，每个反应需1.5μl，50个反应共计75μl，分装成1管，-20℃冻存备用。