[发明专利]猪瘟病毒荧光定量RT－PCR诊断试剂盒

说明书

所属技术领域

本发明所涉及的猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒及其生产方法，属兽用生物制 品领域。

本发明的技术背景

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus，CSFV) 引起的猪的高度致死性、接触性传染病，其特征是小血管壁的变性、导致内脏器官中的多 发性出血、坏死和梗死。目前CSF遍布全世界，根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》(2004) 中，CSF被列为必须报告的法定传染病之一，在我国属于四大动物疫病之一，经济损失严 重。目前临床上CSF在流行特点、临床表现和病理变化等方面表现出非典型性的特征，因 此对其诊断带来困难，必须依赖实验室诊断才能确诊。由于CSFV在细胞内繁殖滴度较低， 并且不产生肉眼可见的病变，对该病原的进一步研究尤其是诊断技术的研究带来了难度， 致使目前CSF的诊断技术研究依然存在许多问题，各种不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度 较低、非特异性反应较严重等诸多问题。

目前常见的CSF病原诊断技术分传统诊断方法和诊断新技术，传统诊断方法主要有猪 瘟免疫荧光技术(HCFA)、琼脂糖扩散法、兔体交互免疫试验和实验动物法等；诊断新技 术有RT-PCR技术和ELISA抗原捕获法等等。免疫荧光技术：又可分为直接免疫荧光和间 接免疫荧光，应用荧光标记的一抗或二抗对组织切片进行染色观察，以检测是否有CSFV 感染。免疫荧光法是目前检测CSF病原的法定方法，但该法需要较昂贵的显微镜和有经验 的试验人员，HCFA技术经验性较强，在制片特别是组织切片过程中难度大，耗时长；组织 抹片的制作也可能由于选定的样品为非病灶区而漏检；细胞飞片受多种因素影响如：细胞 状况好坏、花费时间长，且采用细胞HCFA技术通常会在边缘部分出现非特异性荧光而造 成错检。琼脂糖扩散试验：该法虽操作简单，但敏感性低。实验动物法：用敏感仔猪进行 接种试验或用兔体交互免疫试验进行病原的鉴定，此法可用来鉴别疫苗毒和野毒感染，但 该法需在有条件的实验室进行，而且费时。ELISA抗原捕获法：利用双抗夹心法或竞争法 捕获CSFV于酶标板上，然后利用辣根过氧化物酶标记的二抗进行显色，根据吸光值的高 低来判断有无CSFV，目前这种试剂盒主要靠进口，价格昂贵，而且敏感度较低，不利于普 及。RT-PCR技术：随着分子生物学的发展，越来越多的学者应用RT-PCR和nested-PCR对 CSFV进行了成功扩增。虽然该法具有操作简便，快速，特异性强等优点，但在病毒含量较 低或在RNA提取过程中造成RNA降解等情况下，会出现假阴性结果；此外需要经过反转录、 二次PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，耗时太长而不利于实验室快速检测。

由于上述各种不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度较低、非特异性反应较严重等诸多问 题。因此开发猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断技术对于猪瘟病原的定量检测具有十分重要 的意义。

本发明的目的是将荧光定量PCR技术与ABI定量检测系统相结合，建立CSFV实时 荧光RT-PCR快速检测技术，从而制备用于CSFV快速检测的试剂盒。

本发明的主要技术原理

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction， RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术是通过始 点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，它可以采用绝对定量和相对定量 两种方式实现定量检测。

实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术包括探针类和染料类两种。探针类是利用与靶序列 特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以TaqMan^TM技术为代表，常用的荧光基团是FAM， TET，VIC，HEX；染料类是应用一种能与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与 双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，常用的是 SYBR GreenI染料。