[发明专利]从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法

摘要

一种从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法，它是依次通过常规PCR扩增、单碱基延伸反应标记靶序列、磁珠分离靶序列和生物条形码信号放大及检测的四个步骤，来实现从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的目的。本发明具有成本比较低廉和经济实用等优点，可以准确地从孕妇血浆中检测出胎儿父系DNA中的单核苷酸突变及单核苷酸多态性，还可以从孕妇血浆中检测出胎儿DNA含量。

主权项

1.一种从孕妇血浆中检测胎儿父系DNA单核苷酸差异的方法，其步骤如下：(1)样品处理：抽取孕妇外周血8～15ml，提取血浆游离DNA，取5～10μl，含量为1～100ng的游离DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)技术从血浆游离DNA中扩增目的DNA片段和背景DNA片段。(2)标记靶序列：取聚合酶链式反应(PCR)产物5～10μl，加入碱性磷酸酶，37℃反应20～30分钟后，使过量的脱氧核苷酸(dNTP)去磷酸化，加入与所需检测核苷酸互补的配体标记的脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)1～2μl，浓度为500～2000μmol/L，以目的DNA片段为模板，采用单碱基延伸反应(SBER)技术，标记含有所需检测的游离DNA突变或单核苷酸多态性目的DNA片段——靶序列；(3)磁珠分离靶序列：向上述单碱基延伸反应(SBER)产物中，加入连有配基的磁珠50～100μl，直径为1～10μm，浓度为1～5mg/ml，同时须保证所有磁珠上的配基数目比上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)上的配体要多，37℃反应20～50分钟，使磁珠上的配基与上述标记在脱氧核苷酸(dNTP)或双脱氧核苷酸(ddNTP)的配体通过配基配体反应导致磁珠与靶序列相连，采用磁性分离技术，该技术用磷酸盐缓冲液(PBS)反复悬浮并充分洗涤数次，直至将结合有靶序列的磁珠和未与靶序列结合的磁珠分离出来；(4)生物条形码信号放大及检测：加入连上生物条形码DNA序列和一种与靶序列互补的寡核苷酸片段的纳米级微粒50～100μl，直径为20～40nm，浓度为0.2～2μmol/L，使其与磁珠结合的靶序列通过碱基配对原理进行DNA杂交1～2小时，然后采用磁性分离技术，该技术用磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮和充分洗涤数次，至除去未与靶序列结合的纳米级微粒和与靶序列非特异性结合的纳米级微粒为止，最后加入双蒸消毒水40～50μl，加热至45℃～60℃，使生物条形码DNA序列充分脱离纳米级微粒，再使用实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术或分子杂交技术或生物芯片技术来检测生物条形码DNA序列，从而间接达到检测靶序列含量，实现检测出游离DNA突变或单核苷酸多态性的目的。