[发明专利]甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法

摘要

本发明公开了一种甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法，其步骤是：A.甘蓝农杆菌介导的遗传转化，首先是农杆菌菌液制备，其次是外植体制备，第三是将外植体置于农杆菌液中进行遗传转化，第四是除草剂抗性检测，第五是PCR分子检测；B.转基因甘蓝型油菜的人工合成，首先是白菜细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，其次是甘蓝细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，最后是对人工合成的单倍体油菜进行染色体加倍；C.转基因油菜的鉴定。本发明操作简单，外源目的基因可准确无误地转到甘蓝型油菜C染色体上，所获得的转基因油菜，环境释放时外源转基因扩散的生态风险小。

主权项

1、一种甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法，该方法包括下列步骤： A、甘蓝农杆菌介导的遗传转化：首先是农杆菌菌液制备，将含有bar基因表达载体 pCAMBIA3300质粒的农杆菌菌株LBA4404划线接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养 基上，在28℃培养箱中倒置培养2-3天，待菌落长出后，从YEB平板上挑取一个单菌落， 接种于5mlYEB液体培养基中，置摇床上，培养过夜，取菌液划线接种于附加50mg/L卡 那霉素的YEB平板上，在28℃培养箱中倒置培养2天，见菌落长出后，将培养皿至于4℃冰 箱备用，在甘蓝转基因实验时，取一个单菌落接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养 基上，28℃培养1-2天，用1/2浓度的MS液体培养基洗下菌体，并将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.08； 其次是外植体制备，将甘蓝种子消毒，植入1/2浓度MS培养基上生长4-5天，25℃、光16 小时/暗8小时，切下叶柄长1-2mm的子叶和长0.5-0.7cm的下胚轴分别作为具柄子叶和下 胚轴外植体；第三是遗传转化，将外植体置于农杆菌菌液中，22℃侵染5-10分钟，其间摇 动，在无菌吸水纸上吸干菌液，转至培养基MS+1mg/L2，4-D+0.2mg/L6-苄氨基嘌呤上， 22℃暗培养2-3天，然后转到培养基MS+4.5mg/L6-BA+5mg/LAgNO₃+500mg/L羧苄青 霉素上延迟培养5-7天，再转到筛选培养基MS+4.5mg/L6-BA+5mg/LAgNO₃+500mg/LCb +10mg/L草胺膦上培养3-4周，每2周转接一次，待再生绿苗长至1-2cm时，切下绿苗， 植入生根培养基上，待形成植株时，经炼茁移栽花盆中遮荫保湿培养；第四是除草剂抗性检 测，T₀代转基因植株5-6片真叶期用13.5％的Basta^1∶200倍稀释液喷施，转基因阳性植株 对该除草剂没有反应，表现除草剂抗性，转基因阴性植株在喷药5天后死亡；第五是PCR分 子检测，为避免T₀代转基因植株的假阳性和农杆菌LBA4404污染，选取用草胺膦筛选呈阳性 的T₀代株系植株进行剥蕾自交，获得T₁代种子，将T₁代种子种在网室，苗期用13.5％的Basta^1∶200倍稀释液喷施，取抗性转基因甘蓝和非转基因甘蓝植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取 植物基因组DNA，然后用20ul反应体系对目的基因进行PCR扩增，设阴性对照以非转基因 甘蓝植株总DNA为模板和阳性对照以pCAMBIA3300质粒DNA为模板，反应程序为：95℃，2分 钟；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟，35cycles，72℃，5分钟，PCR产物用1％的 琼脂糖凝胶电泳进行检测，转基因阳性植株与阳性对照均扩增出500bp的条带，检测bar基 因所用的正向引物为：5′-GATCTCGGTGACGGGCAGGA-3′，反向引物为：5′-GGCGGT CTGCACCATCGTCAA-3′； B、转基因甘蓝型油菜的人工合成，首先是白菜细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，以 白菜作母本、转bar基因甘蓝作父本进行种间杂交，取授粉7天后的子房，消毒用70％酒精 5～10秒、1％DICA消毒8～10分钟、无菌水洗3～4次后进行培养，培养基为MS培养基+ 500mg/L水解酪蛋白，待子房培养35～40天后，剥出子房中的种子，将剥出的种子接种在 MS培养基上萌发，直到长成苗，然后转接到生根培养基上生根和扩繁植株，待根系形成后， 经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养；其次是甘蓝细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，以转bar 基因甘蓝作母本、白菜作父本进行种间杂交，取授粉17～20天的子房，消毒后，剥出杂种 胚，进行胚拯救培养，培养基为MS培养基+0.5mg/L6-BA，当胚上长出芽时，切下芽移 植到含0.01％秋水仙碱的MS培养基上，进行7-10天的培养，然后，将苗转入生根培养基中 生根，待根系发达时，移栽花盆中遮荫保湿培养，开花结果，收获种子；第三是染色体加倍， 对人工合成的单倍体油菜采取如下方法进行染色体加倍处理：a、切下幼苗移植于含0.01％秋 水仙碱的MS培养基上处理7～10天，取出苗，切去粘有0.01％秋水仙碱的MS培养基的茎基 部，转到生根培养基上生根和扩繁，每株系至少扩繁3株，待根系形成后，经炼苗移栽花盆 中遮荫保湿培养；b、秋水仙碱溶液浸根处理，将现蕾的植株从土壤中挖出来，洗净根部泥 土，将根浸泡在800mg/L的秋水仙碱水溶液中，4小时之后，用自来水冲洗根部2分钟， 移栽到田间，移栽成活后，剪掉已现蕾的主花序和分枝，使其产生新枝；c、油菜植株现蕾 时，将蘸有0.3％秋水仙碱的棉球置于植株的叶腋处，每天处理2次，连续处理3天； C、转基因油菜的鉴定： a、植株染色体数目观察，首先是种子萌发植株根尖观察法，将种子在10-15℃冷水浸泡 2-4小时，置湿润滤纸上于25℃下萌发，待根长至1～1.5cm时，取根尖在22℃下、0.002mol/L 8-羟基喹啉中处理3小时，用卡诺液固定24小时，然后置于70％乙醇中4℃下保存；其次是 幼小雌蕊观察法：剥取幼小花蕾中的雌蕊，用0.002mol/L8-羟基喹啉处理5小时，用卡诺 液固定24小时，然后置于70％乙醇中4℃下保存；第三是幼小花蕾观察法：将幼小花蕾用 0.002mol/L8-羟基喹啉处理4小时后，转到卡诺液中固定，24小时后转到70％乙醇中4℃下 保存； b、转基因油菜的除草剂抗性检测，人工合成油菜植株5-6叶期，喷施13.5％的Basta^1∶200倍稀释液，5天后调查叶片药害表现，设非转基因油菜喷施对照，转基因油菜没有反 应，非转基因油菜枯死； c、转基因油菜基因组Southernblotting分子检测，采用CTAB法提取植物基因组DNA， 取人工合成的C染色体组转基因甘蓝行油菜、转基因甘蓝、非转基因油菜、非转基因甘蓝材 料基因组总DNA和转基因pCAMBIA3300质粒DNA各20μg，分别用内切酶EcoRI将其消化后 在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，进行预杂交、杂交和洗膜的程序，所用探针为pCAMBIA3300 质粒PCR扩增bar基因的0.5kb片段，检测使用地高辛标记试剂盒进行，质粒、转基因油菜、 转基因甘蓝有特异带出现，转基因油菜与转基因甘蓝带型一致，非转基因油菜和甘蓝没有特 异带出现； d、外源基因位于甘蓝型油菜C染色体上的细胞遗传学验证，以转基因油菜作父本或母 本与白菜杂交，甘白杂种与白菜回交，获得回交一代种子，苗期对回交一代植株进行抗除草 剂涂叶鉴定，不抗除草剂植株叶片出现枯死症状时，将该叶片摘除，并对植株进行PCR分子 检测，根据抗除草剂表型和分子检测结果给每株挂抗、感牌，花期取每株幼小花蕾用 0.002mol/L8-羟基喹啉处理4小时，转到卡诺固定液中固定，24小时后转到70％乙醇中保 存备用，将幼小花蕾中的花药挑出，在60℃下、1M盐酸中解离5分钟，然后在改良卡宝品 红中进行染色、压片，在显微镜下观察、照相，观察到20条染色体的植株都是不抗除草剂， 并且PCR检测为阴性；染色体在21-28条之间的植株出现抗、感除草剂分离；染色体数为29 的植株抗除草剂，PCR分子检测阳性。