[发明专利]水和土壤中的马铃薯青枯病菌检测方法

摘要

本发明为一种水和土壤中的马铃薯青枯病菌检测方法。它采用机械离心富集，TZC半选择性培养基培养富集和DNA分子水平上的PCR扩增富集等三级富集方法，检测水和土壤中的马铃薯青枯病菌。它灵敏、准确，在马铃薯无病种薯繁育和大田生产上有广泛应用前景。

主权项

1、一种水和土壤中的马铃薯青枯病菌检测方法，其步骤如下：(1)机械离心富集：A、收集水样本500-1000ml，在13000-15000rpm下离心8-10min，弃上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下称机械离心富集液)；B、收集土壤100-200克，碾细，过80-100目网筛，加水800-1200ml，浸渍10-16小时，搅动，取水相，在5000-6000rpm下离心5-8min，弃上清液相，加100-200ml灭菌水，冲洗沉淀物，手动振荡1-2min，在5000-6000rpm下离心1-2min，弃沉淀，取水相，在13000-15000rpm下离心8-10min，弃上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下称机械离心富集液)；(2)半选择性培养基TZC培养富集：取灭菌的TZC培养基80-100ml，在无菌条件下加入机械离心富集液，于28-30℃，200-250rpm下振荡培养2-3天；培养液变红色进行第(3)检测，如培养液为其他颜色，则样本中不带有马铃薯青枯病菌；(3)健康马铃薯块接种检测：培养液变红色，取300-500μl菌液接种马铃薯切块，在直径9cm的培养皿中，保湿培养于28-30℃，第4至第5天直接检查马铃薯块发病情况，如马铃薯块组织变软腐烂，其上有乳白色细菌粘液，即所检样本携带有马铃薯青枯病菌；如未发病，则在5000-8000rpm下离心培养液，弃上清和收集细菌；(4)聚合酶链反应(PCR)DNA分子水平上的富集：A、细菌裂解液制备：取约0.5g收集到的细菌，置于1.5ml离心管中，加入400μl1％的TritonX-100，用Parafilm封口，剧烈振荡，使固体重新悬浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，4℃存放待用或直接用于PCR扩增。B、PCR扩增：以马铃薯青枯病菌Hrp基因部分区段设计特异性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列体系和反应程序，在PCR仪上进行扩增：25ul PCR反应体系包括：        10X PCR buffer  2.5μl        2.5mM dNTP      2.0μl        引物P1          0.2μl        引物P2          0.2μl        DNA模板         1.0μl        Taq酶           0.1μl        ddH2O           19.0ul反应程序T＝95℃      5minC、PCR产物检测：取PCR扩增产物5-10μl在1％琼脂糖凝胶中，于80-100V/cm下电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察结果，可以看到1993bp的扩增片段，即所检测的样本中含有马铃薯青枯病细菌。