[发明专利]结缔组织生长因子C区抗原的制备方法

摘要

结缔组织生长因子抗原的制备方法，对pCOMB₃载体双酶切，切除272bp条带后的载体用T4 DNA连接酶自连后转化大肠杆菌，以pET－28(a)⁺作模板扩增，回收550bp条带，将其与切除后的pCOMB₃载体连接，经转化后筛选得阳性质粒；对人内皮细胞原代培养，用牛血清白蛋白对其干预8h，胰蛋白酶消化，用Trizol法提取RNA，合成cDNA，在1.5ml管中加入：ddH₂O31.5μl，10×Taq buffer5μl，10mol/L dNTP 1μl，25pmol/μl的引物，0.65μg/μl的cDNA模板10μl，5U/μl的TaqPlus0.5μl，94℃5min变性，94℃1min，65℃30sec，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保温下扩增，对PCR产物与阳性质粒双酶切后，用T4DNA连接酶相连两个片段，转化大肠杆菌JM109，得pKMcl；将pKMcl的大肠杆菌单菌落扩增，用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷37℃诱导3h，得大肠杆菌，超声破碎，层析得结缔组织生长因子抗原。

主权项

1、一种结缔组织生长因子C区抗原的制备方法，其特征在于第一步：用NheI和XbaI酶对pCOMB3载体进行双酶切，切除两酶切位点NheI和XbaI之间的272bp条带后的载体用T4 DNA连接酶自连后转化大肠杆菌JM109，然后，以质粒pET-28(a)+作模板，分别以p1：5’-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3’及p2：5’-GGACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3’为上、下游引物，PCR扩增后，可见550bp条带的扩增产物，回收该条带，并将回收的条带与被切除272bp后的pCOMB3载体连接，经转化JM109后筛选得到阳性质粒pKM；第二步：用组织贴壁法进行人内皮细胞原代培养，用50mmol/L葡萄糖修饰的牛血清白蛋白对原代培养后的内皮细胞干预8h，0.125％胰蛋白酶消化后，用Trizol法提取RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，在1.5ml管中依次加入：双蒸H2O 31.5μl，10×Taq buffer 5μl，10mol/LdNTP 1μl，浓度为25pmol/μl的引物p3：5’-CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3’1μl，p4：5’-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3’1μl，浓度为0.65μg/μl的cDNA模板10μl，浓度为5U/μl的TaqPlus聚合酶0.5μl，置于PCR仪扩增，扩增条件：94℃ 5min变性，94℃ 1min，65℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保温，再用SpeI和XhoI酶对PCR产物与阳性质粒pKM分别进行双酶切后，用T4DNA连接酶使两个片段通过粘性末端相连，转化大肠杆菌JM109，从中获得阳性质粒pKMc1；第三步：将含阳性质粒pKMc1的大肠杆菌JM109单菌落扩增后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃诱导3h，得到含有结缔组织生长因子C区242-349位氨基酸的大肠杆菌，超声破碎细胞，用镍离子树脂亲和层析获得结缔组织生长因子抗原。