[发明专利]一种基因定点突变方法和以此方法获得的抗草甘膦基因及其表达载体和转化子

摘要

本发明涉及一种基因定点突变方法和通过该方法获得的重组aroA基因、以及含有此基因的载体和转化子。本方法选用“需突变的位点与一单酶切位点相距10－20个碱基”的DNA序列作源模板，按源模板的序列特点设计出相对应的一个5’－端引物和两个3’－端引物，并采用两步PCR扩增反应，得到引入点突变的基因片段。运用该方法，可以人为加大发生基因突变的准确性。本发明还应用该定点突变法，把通过基因优化法获得的基因aroA－M1作进一步改良，获得活性更高而草甘膦敏感度更低的EPSP合成酶基因aroA－M142；aroAM142编码的酶具有比野生型低得多的K[PEP]，而K[Glyphosate]却明显增加，既提高了酶的催化效率，又减低了酶与草甘膦的亲和力，使酶抵御草甘膦的能力大幅度提高；酶的性质也得到了进一步的改良。

主权项

1.一种基因定点突变的方法，其特征是选用具有如下结构特点的DNA序列作源模板：需突变的位点与一单酶切位点相距10-20个碱基；根据该源模板序列设计一个5′端引物和两个3′端引物；两个3′端引物间有10-20个碱基的重叠序列，并且其一带有需要在扩增产物中引入的突变序列，另一带有需要在扩增产物中引入的酶切位点；由5′端引物和带有突变序列的3′端引物进行第一轮PCR扩增反应，把突变位点引入扩增产物；再以此扩增产物为模板，利用原5′端引物和带有酶切位点的3′端引物进行第二轮扩增，把酶切位点引入到前述带突变位点的序列的3′端；再通过酶切片段的互换，用该序列取代源模板上的相应序列，实现定点突变。