[发明专利]基于转录的核酸扩增方法和组合物

摘要

公开了靶多核苷酸等温指数级扩增的方法。该方法应用两个转录组件，第一组件提供产生RNA转录本的线性扩增，且第二组件提供进一步的(通常为循环的)产生更多RNA转录本的扩增。一方面，第一组件的扩增基于复合引物。第二方面，第一组件的扩增基于靶转换，以产生包含启动子序列的引物延伸产物。在所有的方面中，第一转录组件的RNA转录本通过产生包含可启动转录的双链启动子区域的中间产物而进行进一步的扩增。本发明还提供了用于实践所述方法的组合物和试剂盒，并提供了使用扩增结果的方法。

主权项

1.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：(a)将包含目的核酸序列的单链靶多核苷酸与第一引物杂交，其中所述第一引物为包含RNA部分和3′DNA部分的复合引物；(b)任选地将包含终止多核苷酸序列的多核苷酸与靶多核苷酸5′的区域杂交，其中所述靶多核苷酸5′的区域为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交位点而言；(c)用DNA依赖的DNA聚合酶延伸第一引物，以产生包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体；(d)使用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶从第一引物延伸产物和靶多核苷酸复合体的复合引物上切除RNA部分，以使另一复合引物可与靶多核苷酸杂交，并通过链置换重复引物延伸，以产生置换的引物延伸产物；(e)杂交前启动子多核苷酸，其中所述前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与置换的引物延伸产物在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下杂交的区域，以便产生包含与置换的引物延伸产物有互补序列的RNA转录本；(f)将第二引物与步骤(e)的RNA转录本杂交；(g)用RNA依赖的DNA聚合酶延伸第二引物，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；(h)用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除步骤(g)复合体中的RNA；(i)将单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下杂交的区域，从而产生包含目的序列的RNA转录本；由此产生多拷贝目的核酸序列。