[发明专利]野山参与栽培参非细胞DNA克隆鉴定方法

摘要

本发明涉及野山参与栽培参的鉴定方法。本发明依据野山参与栽培参的DNA特征,采用随机扩增多态DNA(RAPD)方法,提供了一种准确、灵敏、方便的野山参与栽培参鉴定方法。本发明的非细胞DNA克隆鉴定方法包括DNA提取、DNA纯化、DNA扩增、电泳分析和结果判断等步骤。本发明的鉴定方法对人参的鉴别具有很大的社会和经济价值。

主权项

1、一种野山参与栽培参非细胞DNA克隆鉴定方法，其特征在于该鉴定方法包括下列步骤：(1)DNA的提取分别取已知的野山参根、栽培参根和待测样品参根0.1～0.5g，研磨成细粉，移入离心管，加入CTAB抽提缓冲液，及等体积的氯仿∶异戊醇＝24∶1抽提，离心；将上清液吸入离心管，加入异丙醇混匀后放入-20℃冰箱保存，再次离心；去上清液，沉淀加入TE缓冲液溶解，加1～2倍体积的无水乙醇混匀，冰箱放置；取出后，离心，去上清液，沉淀用乙醇洗涤，自然阴干；加无菌水溶解，吸取部分DNA溶液稀释备用；(2)DNA提取液的纯化分别将已知野山参、栽培参和待测样品的DNA提取液离心，沉淀溶解于TE缓冲液中，加入2/3体积的乙醇再沉淀、离心，取沉淀物备用；(3)DNA的扩增分别取上述纯化后的野山参、栽培参及样品的DNA提取物进行DNA扩增：a.反应的总体积为25μl。各反应成分的浓度分别为Mg2+浓度1.0～4.0mM、dNTP浓度0.1～0.4μM，引物浓度0.4～3.2μM，纯化后的DNA提取物浓度为稀释10～20倍，Taq酶浓度0.5～2.0unit；b.用全自动PCR仪进行DNA扩增，反应程序为：①92～94℃变性3～5分钟35～37℃复性1～2分钟70～74℃延伸2～3分钟，1个循环②92～94℃变性1～2分钟35～37℃复性1～2分钟70～74℃延伸2～3分钟，40个循环③72℃延伸10分钟，1个循环(4)电泳测定将上述经PCR扩增得到的野山参、栽培参和样品的DNA扩增产物进行电泳测定，电泳的材料为含0.05％EB的1.5％～2％琼脂糖凝胶，电泳的缓冲液为1×TAE，电泳时的电压为100伏，电泳的时间为45分钟左右。在电泳时加λDNA/EcoRI+HindIIImarker做为分子量标记；(5)结果分析电泳后，在紫外灯下观察拍照，将样品的电泳图与野山参、栽培参电泳图对照，进行判别，如样品具有野山参相应条带则样品为野山参，如无野山参相应条带，与栽培参条带相似则为栽培参。