本发明提供了一对特异性COI引物及其在快速鉴定棘胸蛙中的应用。本发明基于棘胸蛙线粒体基细因序列(SEQ ID NO.1)设计一对特异性COI引物,包括:核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的反向引物。本发明提供的特异性COI引物只对黑斑棘胸蛙和黑白棘胸蛙具有扩增能力,对金线棘胸蛙无扩扩增能力。本发明操作简单,快速高效地检测鉴定不同花斑的棘胸蛙,为棘胸蛙的快速鉴定提供极大便利,为不同花斑棘胸蛙的鉴定提供了分子依据,同时在棘胸蛙选育过程中提出不良隐性基因。