本发明涉及生物催化领域,特别涉及乙醇酸氧化酶突变体及其应用。本发明公开了一种乙醇酸氧化酶突变体CreGO‑Mut及其在合成乙醛酸甲酯中的应用,所述乙醇酸氧化酶突变体CreGO‑Mut是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第27位酪氨酸突变为丝氨酸,同时将第111位缬氨酸突变为甘氨酸,同时将212位缬氨酸突变为精氨酸获得的。乙醇酸氧化酶突变体CreGO‑Mut相较于野生型CreGO活力提高了3.23倍。融合酶GST‑GSG‑CreGO‑Mut作为催化剂,过氧化氢酶CAT作为辅助酶,再结合氧气鼓泡,300mM乙醇酸甲酯经8h酶法氧化反应后,乙醛酸甲酯得率达93.5%。