本发明公开了靶向MSLN和4‑1BB的双特异性抗体及其应用。本发明所提供的靶双特异性抗体含有MSLN抗原结合结构域(即纳米抗体可变区,CDR1、CDR2和CDR3依次如SEQ ID No.5第484‑491位、第509‑515位和第554‑565位所示)和4‑1BB抗原结合结构域(重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如SEQ ID No.5第31‑35位、第50‑65位和第98‑106位所示;轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如SEQ ID No.7第24‑34位、第50‑56位和第89‑97位所示)。本发明所提供的双特异性抗体具有良好的T细胞激活效应,并且在此基础上表现出良好的体外肿瘤细胞杀伤效果和体内肿瘤抑制效应,因此,本发明所提供的双特异性抗体用于制备抗体靶向药物具有重要意义和应用潜力。