本发明适用于生物技术和医学领域,提供了一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒,该试剂盒包含第一反应液、第二反应液及石蜡,该第一反应液包含:反应缓冲液,针对伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2和特异性探针SEQ ID NO:3,以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5和特异性探针SEQ ID NO:6;该第二反应液包含DNA聚合酶O。本发明还提供了该试剂盒在伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。本发明的检测试剂盒缩短了检测时间,避免样本间交叉污染,结果准确可靠。