本发明属于生物领域,公开了一种表达H9亚型禽流感双拷贝HA基因的Ⅶ型致弱新城疫重组病毒,所述病毒为rDHN3mF‑2HA、rDHN3mF‑HA,rDHN3mF‑2HA的序列如序列表SEQ IDNO:1所示;rDHN3mF‑HA的序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明的病毒在rDHN3‑mF病毒基因组的P基因和M基因之间的非编码区之间表达全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2AIV的HA蛋白的新城疫基因VII型减毒株重组病毒rDHN3mF‑2HA,经WB验证表明增加HA的可溶性表达与原HA基因相比,其表达效率更高。该重组病毒有望进一步开发成抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗;同时,本发明还提供了该病毒的制备方法、用途,此外还涉及关键质粒的制备方法。