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[发明专利]一种产漆酶重组毕赤酵母工程菌株的构建方法-CN202111579365.0有效
发明人：高庆华;罗同阳;王玥;董聪;王庆庆;王云鹏;马清河;马金国 -专利权人：河北省微生物研究所有限公司
申请日： 2021-12-22 - 公布日： 2023-07-28 - 主分类号： C12N15/81 文献下载
摘要：本发明公开了一种产漆酶重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，涉及生物工程技术领域，包括以下步骤：S1：将漆酶基因连接到质粒载体上，得重组质粒pPIC9K‑Laccase；S2：将重组质粒pPIC9K‑Laccase转入毕赤酵母X33感受态细胞中，培养，得阳性转化子X33/pPIC9K‑Laccase感受态细胞；S3：将阳性转化子X33/pPIC9K‑Laccase感受态细胞与分子伴侣Hac1融合，培养，对所得菌株漆酶的活力进行筛选，得产漆酶重组毕赤酵母工程菌株。该方法构建的工程菌株漆酶活力高，稳定性好。
一种产漆酶重组酵母工程菌株构建方法

[发明专利]一种添加絮凝剂辅助毕赤酵母发酵液固液分离的方法-CN202211629372.1在审
发明人： 罗同阳;高庆华;王玥;董聪;王庆庆;贾振华;马清河;秦艳梅;马金国 -专利权人：河北省微生物研究所有限公司
申请日： 2022-12-19 - 公布日： 2023-03-28 - 主分类号： C07K1/30 文献下载
摘要：本发明属于重组蛋白分离纯化制备领域，具体涉及一种添加絮凝剂辅助毕赤酵母发酵液固液分离的方法。本发明毕赤酵母发酵液由于菌体量多且黏度大，因此结合无机絮凝剂和有机絮凝剂，通过其发挥各自不同的作用达到最佳絮凝效果。
一种添加絮凝辅助酵母发酵液固液分离方法

[发明专利]一种提高葡萄糖氧化酶产量的方法-CN202211399008.0在审
发明人：王庆庆;罗同阳;高庆华;董聪;王玥;王云鹏 -专利权人：河北省微生物研究所有限公司
申请日： 2022-11-09 - 公布日： 2023-01-31 - 主分类号： C12N9/04 文献下载
摘要：本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种利用氯化血红素提高葡萄糖氧化酶产量的方法。是将保藏编号为CGMCC NO.18909的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括菌株培养阶段、碳源流加阶段、饥饿培养阶段、诱导表达阶段在诱导过程加氯化血红素溶液。该菌株表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活1308U/mL。本发明有效解决了现有技术中生产制备的青霉葡萄糖氧化酶酶活较低的问题，具有同体积发酵液获得更高的青霉葡萄糖氧化酶产量等优点。
一种提高葡萄糖氧化酶产量方法

[发明专利]利用维生素B2-CN202011417612.2有效
发明人：董聪;高庆华;罗同阳;王玥;王庆庆;马金国;樊晓东;马清河;秦艳梅 -专利权人：河北省微生物研究所有限公司
申请日： 2020-12-05 - 公布日： 2022-10-28 - 主分类号： C12N9/04 文献下载
摘要：本发明涉及一种发酵制备葡萄糖脱氢酶的方法，特别是指一种利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法。是将保藏编号为CGMCC NO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括菌株培养阶段、碳源饲喂阶段、饥饿饲喂阶段、诱导表达阶段在诱导过程加维生素B2水溶液。本发明有效解决了现有技术中生产制备的葡萄糖脱氢酶酶活较低的问题，具有同体积发酵液获得更高的葡萄糖脱氢酶产量等优点。
利用维生素 base sub

[发明专利]一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用-CN202011577731.4有效
发明人：高庆华;王玥;罗同阳;董聪;王庆庆;王云鹏;马清河 -专利权人：河北省微生物研究所有限公司
申请日： 2020-12-28 - 公布日： 2022-10-11 - 主分类号： C12N1/19 文献下载
摘要：本发明公开了一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明以优化改造后的透明质酸酶基因pl‑8为目的基因，构建重组质粒pPIC9K‑PL‑8，导入毕赤酵母X33感受态细胞中获得转化子X33/pPIC9K‑PL‑8，将转化子与融合载体pPICZB/PDI融合，获得重组菌株X33/pPIC9K‑PL‑8PDI。本发明获得的透明质酸酶工程菌在发酵罐的放大培养中，可有效提高发酵上清液中透明质酸酶的含量和酶活。
一种透明质酸酶工程及其构建方法应用

[发明专利]基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法-CN202210604030.8在审
发明人：董聪;王玥;高庆华;罗同阳;刘攀;王庆庆 -专利权人：河北省微生物研究所有限公司
申请日： 2022-05-31 - 公布日： 2022-08-12 - 主分类号： C12N15/81 文献下载
摘要：本发明提供了一种筛选高表达FAD‑GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，包括如下步骤：通过同尾酶法构建了FAD依赖的葡萄糖脱氢酶FAD‑GDH的2‑4拷贝重组表达载体pPICZαA‑2GDH、pPICZαA‑3GDH和pPICZαA‑4GDH；其中在试管水平，单拷贝平均酶活11.953U/mL，二拷贝平均酶活27.99U/mL，三拷贝平均酶活44.792U/mL，四拷贝平均酶活57.027U/mL；分别比单拷贝提高2.34、3.75、4.78倍；选择单拷贝菌株和四拷贝菌株进行10L罐扩大培养，单拷贝菌株诱导108h酶活达到最高697.125U/mL，四拷贝菌株诱导132h酶活达到最高1063.279U/mL，比单拷贝酶活提高52.52％。本发明表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高FAD‑GDH的表达量。
基于基因拷贝筛选表达 fad gdh 重组酵母菌株方法

[发明专利]吡喃糖氧化酶基因及制备、利用其构建的巴斯德毕赤酵母及应用-CN201811323600.6有效
发明人：王玥;高庆华;刘蕾;董聪;王庆庆;罗同阳;马清河 -专利权人：河北省微生物研究所有限公司
申请日： 2018-11-08 - 公布日： 2022-05-24 - 主分类号： C12N15/53 文献下载
摘要：本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种吡喃糖氧化酶基因、利用其构建的巴斯德毕赤酵母及应用。本发明主要利用密码子优化软件对吡喃糖氧化酶的密码子进行优化，使其均成为毕赤酵母偏爱密码子，然后利用基因合成的手段合成目的基因；转化至毕赤酵母实现目的蛋白的高效表达，利用本发明制备的重组毕赤酵母具有发酵酶活高，为吡喃糖氧化酶的应用奠定了良好的基础，有效避免了在大肠杆菌中表达产生的弊端，开辟了一条全新的吡喃糖氧化酶的工业化高效生产途径等优点。
吡喃糖氧化酶基因制备利用构建巴斯德毕赤酵母应用

[发明专利]一种筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法-CN202111133183.0在审
发明人：董聪;王玥;高庆华;罗同阳;王庆庆;刘攀 -专利权人：河北省微生物研究所有限公司
申请日： 2021-09-27 - 公布日： 2021-11-30 - 主分类号： C12N1/19 文献下载
摘要：本发明提供了一种筛选高表达FAD‑GDH的重组毕赤酵母菌株的方法。包括如下步骤：通过依次使用Zeocin、G418及G418浓度梯度筛选，以增加重组菌中FAD‑GDH基因拷贝数。首先，利用前期获得的密码子偏好性优化的FAD‑GDH基因片段分别与表达载体pPICZαA、pMD连接，构建重组表达载体pPICZαA‑GDH和pMD‑GDH；然后，将pPICZαA‑GDH电转入毕赤酵母X33构建重组子，使用Zeocin及试管发酵筛选获得毕赤酵母重组菌株X33‑GDH‑2，将其制成感受态；最后将pMD‑GDH电转入X33‑GDH‑2感受态细胞，利用G418浓度梯度平板和试管发酵进行筛选。结果表明，转入pMD‑GDH后100μg/mlG418平板上的转化子X33‑GDH‑2‑1酶活比X33‑GDH‑2提高94％；2000μg/mlG418梯度平板上菌株X33‑GDH‑2‑17酶活最高，比X33‑GDH‑2‑1提高97％。结果表明了依次使用不同筛选标记及浓度梯度策略有助于提高FAD‑GDH的表达量。
一种筛选表达 fad gdh 重组酵母菌株方法

[发明专利]产葡萄糖氧化酶毕赤酵母发酵液的固液分离方法-CN202011283747.4在审
发明人： 罗同阳;高庆华;王玥;董聪;王庆庆;马金国;樊晓东;马清河;秦艳梅 -专利权人：河北省微生物研究所
申请日： 2020-11-17 - 公布日： 2021-02-19 - 主分类号： C12N9/04 文献下载
摘要：本发明属于发酵液的后提取，特别是指产葡萄糖氧化酶毕赤酵母发酵液的固液分离方法。包括按照公开号为CN107937360A的文献中公开的方法制备产葡萄糖氧化酶毕赤酵母发酵液并调节发酵液pH值；将壳聚糖溶于醋酸溶液制成壳聚糖溶液，在上述壳聚糖溶液中加入无水乙醇，制成混合液；在常温条件下将混合液与调节pH后的发酵液混合均匀并搅拌后静置；将制成的物料高速离心去除菌体，获得含有葡萄糖氧化酶的上清液。本发明有效解决了现有技术中存在的菌体去除效果差，酶活回收率低等问题，具有菌体去除效果好、酶活回收率高、所制备的葡萄糖氧化酶稳定性好等优点。
葡萄糖氧化酶酵母发酵分离方法

[发明专利]一种产(+)γ-内酰胺酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用-CN201711077526.X有效
发明人：王玥;高庆华;刘蕾;董聪;王庆庆;罗同阳 -专利权人：河北省微生物研究所
申请日： 2017-11-06 - 公布日： 2020-04-21 - 主分类号： C12N15/81 文献下载
摘要：本发明提供了一种产(+)γ‑内酰胺酶的重组毕赤酵母及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明提供了包含(+)γ‑内酰胺酶基因的重组质粒，(+)γ‑内酰胺酶基因经在591位点经密码子偏好性调整后在序列两端添加EcoRI限制酶切位点和NotI限制酶切位点，且在3’端加上六个组氨酸标签。所述重组毕赤酵母菌是以巴斯德毕赤酵母菌为表达宿主，包括所述重组质粒。产(+)γ‑内酰胺酶的重组毕赤酵母在发酵生产(+)γ‑内酰胺酶中的应用。与原核表达载体相比，采用酵母为表达载体的(+)γ‑内酰胺酶的产酶量提高了58％。
一种内酰胺重组酵母及其构建方法应用

[发明专利]一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法-CN201711406416.3有效
发明人：高庆华;王玥;董聪;王庆庆;罗同阳;刘蕾;王云鹏 -专利权人：河北省微生物研究所
申请日： 2017-12-22 - 公布日： 2020-04-17 - 主分类号： C12N9/04 文献下载
摘要：本发明涉及微生物发酵技术领域，公开了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法，该方法以保藏编号为CGMCC No.11626的毕赤酵母基因工程菌为出发菌株，采用体积比为20:1的甲醇和山梨醇进行诱导发酵，能够进一步提高GOD产量，下罐酶活达到905U/mL。
一种葡萄糖氧化酶酵母中的高密度发酵方法

[发明专利]毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用-CN201911362360.5在审
发明人：王庆庆;高庆华;董聪;王玥;罗同阳;王云鹏;马清河;秦艳梅 -专利权人：河北省微生物研究所
申请日： 2019-12-26 - 公布日： 2020-03-20 - 主分类号： C07K14/39 文献下载
摘要：本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用。是以GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC和ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为特异引物，以毕赤酵母Pichia p astoris GS115的基因组DNA为模板，采用PCR扩增方法获得毕赤酵母转录因子HAC1，并成功构建了巴斯德毕赤酵母工程菌。本发明解决了目前如果重组蛋白不能正确折叠成天然构象，就会影响异源蛋白正常分泌表达的问题，具有将高效重组微生物技术和蛋白质工程技术相结合，提高了青霉来源GOD酶活等优点。
酵母转录因子 hac1 蛋白巴斯德毕赤及其制备应用

[发明专利]葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法-CN201911103871.5在审
发明人： 罗同阳;高庆华;董聪;王玥;王庆庆;马清河;秦艳梅 -专利权人：河北省微生物研究所
申请日： 2019-11-13 - 公布日： 2020-01-17 - 主分类号： C12N9/96 文献下载
摘要：本发明属于酶制剂的制备，特别是指葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法。按照公开号CN107937360A中的方法制备含有葡萄糖氧化酶的发酵液；将含有葡萄糖氧化酶的发酵液高速离心去除发酵液中的菌体，将离心后上清液用无水乙醇纯化后用磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活；加入PEG2000作为冻干保护剂使其充分溶解并在酶液中分布均匀；预冻后置于真空冷冻干燥剂内冷冻干燥得到淡黄色葡萄糖氧化酶冻干粉。本发明解决了目前葡萄糖氧化酶直接进行冷冻干燥导致的酶活回收率低的问题，具有葡萄糖氧化酶冻干粉酶活回收率高、易于保存和运输、为葡萄糖氧化酶应用于生物医药、饲料及食品加工等领域提供了便利等优点。
葡萄糖氧化酶冻干粉发酵液酶活制备回收率磷酸盐缓冲液冻干保护剂高速离心生物医药无水乙醇真空冷冻淡黄色干燥剂酶制剂上清液食品加工菌体酶液去除稀释预冻溶解饲料保存便利应用运输

[发明专利]利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、毕赤酵母菌及制备和应用-CN201911033580.3在审
发明人：董聪;王玥;高庆华;王庆庆;罗同阳;马清河;马金国 -专利权人：河北省微生物研究所
申请日： 2019-10-28 - 公布日： 2019-12-31 - 主分类号： C12N15/53 文献下载
摘要：本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、毕赤酵母菌及制备和应用。本发明是将毕赤酵母中EroⅠ、PDI、CNE1、SEC53等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZ等系列衍生质粒连接，并与P2O共表达转化入Pichia pastoris GS115菌株中，涂布于不同博来霉素浓度梯度YPD平板上考察其效果，通过分子伴侣共表达和发酵条件优化，经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达吡喃糖氧化酶的菌株，该菌株表达的吡喃糖氧化酶在10L发酵罐上酶活达405U/mL，比没有分子伴侣共表达菌株酶活提高1倍，为吡喃糖氧化酶规模化生产奠定了良好基础。
吡喃糖氧化酶分子伴侣菌株毕赤酵母共表达构建酶活毕赤酵母菌共表达菌株规模化生产制备和应用表达载体发酵条件分泌表达浓度梯度筛选鉴定衍生质粒等基因发酵罐工程菌新基因制备蛋白克隆基因转化优化考察

[发明专利]葡萄糖氧化酶基因Glox、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用-CN201711335811.7在审
发明人：高庆华;胡美荣;董聪;王玥;王庆庆;陶勇;罗同阳;王云鹏;马清河 -专利权人：河北省微生物研究所;中国科学院微生物研究所
申请日： 2017-12-14 - 公布日： 2018-05-08 - 主分类号： C12N15/53 文献下载
摘要：本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种葡萄糖氧化酶基因Glox及巴斯德毕赤酵母的制备、构建和应用。是以5￠端ATGAAGCTCCTTGGCCTCC和3￠端CTAATTAACAGTAGCGTTGTAATC为特异引物，以扩展青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法获得葡萄糖氧化酶基因Glox，并成功构建了巴斯德毕赤酵母工程菌。本发明解决了目前重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达的问题，利用本发明获得了全长的Glox基因及其构建的穿梭表达载体，进一步转化到毕赤酵母X33菌株，经筛选鉴定得到一株较原始菌株较高分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。本发明方法简单易行，成本低廉，这为葡萄糖氧化酶大规模生产奠定了良好的基础。
葡萄糖氧化酶基因 glox 蛋白巴斯德毕赤酵母及其制备应用

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