本发明公开了检测多主棒孢B‑I280V突变的引物组合。本发明公开的引物组合由引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、引物LPF和引物LPB组成,各引物的序列分别如序列表的SEQ ID No.1‑SEQ ID No.6所示。实验证明,本发明的引物组合具有特异性强,灵敏度高,检测时间短,操作简易的特点,可特异、快速、高效地检测到黄瓜棒孢叶斑病发病组织中多主棒孢B‑I280V突变体,不需要复杂的仪器,并实现可视化,为有效发现田间多主棒孢B‑I280V抗性突变类型,制定有效抗药性治理方案提供技术支持。