本发明涉及抗结核分枝杆菌MPT64蛋白单克隆抗体的重链和轻链可变区基因和编码的多肽及其应用。一种抗结核分枝杆菌MPT64蛋白单克隆抗体,即mAb MPT64‑A5B2,其重链可变区基因具有SEQ ID NO.1的序列,轻链可变区基因具有SEQ ID NO.3的序列。其重链可变区基因编码多肽具有SEQ ID NO.2的序列,其轻链可变区基因编码多肽具有SEQ ID NO.4的序列。MPT64‑A5B2单克隆抗体具有良好的特异性。所述的单克隆抗体MPT64‑A5B2重链和轻链可变区基因及编码的多肽作为制备结核分枝杆菌的试剂、疫苗和药物的应用,具有较好的应用前景。