本发明属于病毒基因重组技术领域,具体涉及利用非同源重组机制,将外源DNA片段定点、定向地高效插入特定大型DNA病毒基因组。本发明包括下列步骤:1)设计并构建针对DNA病毒基因组特定切割位点的CRISPR‑Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR‑associated protein 9)系统;2)设计并构建携带一个及以上相同切割位点的外源基因供体;3)将CRISPR‑Cas9系统表达载体和外源基因供体按照一定比例和顺序导入特定细胞;4)经过一段时间,根据病毒特性,选择合适的感染时间点和感染复数,将病毒感染细胞;5)选择优化的时间点收集病毒感染后产生的子代重组病毒;6)分离、筛选和鉴定目标重组子代DNA病毒。利用该方法能够显著提高外源基因定点定向插入DNA病毒基因组的重组效率,进而缩短重组病毒的构建和筛选时间。