[发明专利]疫苗

说明书

发明领域：

本发明涉及新鉴定的肽和编码这些肽的多核苷酸以及携带这些肽的嵌合蛋白。本发明还涉及一种用于分离这些肽或嵌合蛋白的方法和用于治疗流感嗜血杆菌感染的疫苗组合物。

发明背景

流感嗜血杆菌(Hi)是一种革兰氏阴性球杆菌和严格的人类共生体。流感嗜血杆菌菌株(Hi)或是包裹在多糖内荚膜或是没有荚膜，因而也就相应地分为可分型的(有荚膜)和不可分型的(没有荚膜)菌株。

带有荚膜的致病原流感嗜血杆菌(Hi)主要，但并非唯一地导致六岁以下儿童的侵袭性疾病。例如，流感嗜血杆菌b型(Hib)是在儿童中引发脑(脊)膜炎和其它侵袭性疾病的一个主要原因。抗Hib感染已经有了有效的疫苗，它以产生多糖荚膜的抗体为基础，并因而对不可分型的流感嗜血杆菌(ntHi)引发的感染无效。

不可分型的流感嗜血杆菌(ntHi)是主要定居菌株而且，尽管鲜有侵袭性，但是它仍是绝大多数粘膜疾病，包括中耳炎、窦炎、慢性结膜炎和慢性下呼吸道感染或其恶化的原因。目前，大约30％，最多62％的ntHi具有青霉素抗性。带菌状态在儿童中估计占44％，在成年人中约占5％，并能持续数月。但是由ntHi引发的中耳炎无论致病机理，还是宿主免疫反应，现在均没有完全弄清楚。

中耳炎是两岁以下儿童中的较常见疾病。患者在中耳处有流体的出现并伴随有急性的局部或全身性疾病的征兆。急性的征兆包括耳痛、耳干、听力丧失而全身性症状有发热、无力、兴奋、厌食、呕吐或腹泻。肺炎链球菌和不可分型的流感嗜血杆菌(ntHi)是导致该症状的最主要细菌，大约分别占所培养细菌的25-50％和15-30％。另外，ntHi引起53％的复发性中耳炎。1岁和3岁的儿童分别有大约60％和80％有该病的至少一种症状(峰值约为10个月)。

已有证据表明，对ntHi存在保护性免疫。然而，表位的抗原漂移(外膜蛋白P2,P4,P6)在ntHi逃避宿主免疫防御的能力上扮演着重要的角色。

因此，需要另外一种有效的抗流感嗜血杆菌的疫苗，尤其抗无荚膜流感嗜血杆菌的疫苗，其不受当前应用的Hi多糖疫苗的影响。

菌毛是发现于ntHi表面的附属物，在慢性中耳炎儿童的中耳和鼻咽处收获的细菌中100％有菌毛。包含菌毛蛋白(一种衍生自ntHi的菌毛的丝状蛋白)的疫苗已有报道(WO 94/26304)。菌毛蛋白和ntHi外膜蛋白P5同源，此P5蛋白已经成为另一项专利申请的主题(EP680765)。P5样蛋白这种菌毛蛋白能诱导产生和细菌表面发生相互作用的抗体并为杀菌性蛋白(WO94/26304)。该蛋白已经纯化并显示出能够诱导针对各种不同的ntHi的免疫反应。

从细菌外膜分离菌毛蛋白的现有方法既烦琐又耗时。一种在其它种细菌中使用的策略是生产天然蛋白的相对较短的线性肽。然而这种方法使用价值有限，因为这类改变的免疫原的抗体常常不能识别天然病原体。

LB1(f)是一个有19个氨基酸的肽(SEQ ID NO:5)，它衍生自菌株ntHi1128上P5样菌毛蛋白的序列(占据117位精氨酸到135位甘氨酸之间的区段)。该肽最初通过分析P5样菌毛蛋白的一级序列而鉴定为潜在的B细胞表面表位。用包括LB1(f)肽、连接肽和T细胞表面表位的菌毛蛋白嵌合肽(称为LB1肽)免疫动物，可诱导针对P5样菌毛蛋白的免疫应答和减少动物接触ntHi后ntHi的体内定居(见US5,843,464),LB1肽在体内具有免疫原性，其抗血清可与变性的或天然的菌毛蛋白发生免疫应答。因此该肽可作为有效的免疫原，因为它能产生识别并结合其天然结构上的表位的抗体。这部分是由于合成的LB1(f)肽可以模拟菌毛蛋白中肽的卷曲螺旋型二级结构。

在疫苗中仅使用一种流感嗜血杆菌的蛋白质抗原的问题是，保护作用可能很大程度上被限制在同源菌株的攻击上[Bakaletz等(1997)疫苗15:955-961；Haase等(1991)感染与免疫．59:1278-1284；Sirakova等(1994)感染与免疫.62:2002-2020]。ntHi外膜蛋白的抗原多样性意味着，开发针对ntHi异源性微生物的广谱有效疫苗需要新的策略。

如下，本发明涉及LB1(f)肽作为疫苗的更有效应用，该疫苗是针对广泛的能表达P5样菌毛蛋白(或该蛋白的天然变体)的流感嗜血杆菌异源株。

发明概述