[发明专利]具有细胞靶向特异性和诱导凋亡活性的嵌合蛋白

说明书

1．导论

本发明涉及具有细胞靶向特异性和诱导细胞凋亡活性的嵌合蛋白。尤其是，本发明通过一种人白介素-2(IL2)和Bax之间的重组嵌合蛋白说明。所述的嵌合蛋白特异地靶向表达IL2受体(IL2R)的细胞并诱导细胞特异的凋亡。根据本发明，嵌合蛋白可以在任何结合特异细胞类型的分子和诱导凋亡的蛋白之间产生。上述嵌合蛋白用于体外或体内选择性地消除特异的细胞类型，并且可以用于治疗自身免疫病、癌症和诸如病毒感染的传染病。

2．发明背景

2.1.免疫毒素

单克隆抗体技术和重组DNA技术的出现导致发现大量的与特异细胞群体有关的细胞表面分子。根据这些分子的表达类型，构建了重组免疫毒素，以特异地靶向和摧毁表达上述分子的细胞。重组免疫毒素是一类靶向分子，设计用于识别和特异地摧毁表达特异受体的细胞，如癌细胞和涉及许多免疫系统失调的细胞。一般来说，免疫毒素利用一种细菌或植物毒素去摧毁不需要的细胞。通过基因融合技术设计并构建这些分子，它们由靶向细胞部分和杀死细胞部分构成，这是一种治疗用的这些药剂强有力分子的组合。免疫毒素的实例是生长因子或抗体的结合抗原结构域，包括融合各种毒素分子突变形式的抗体Fv部分(单链免疫毒素)。不过，数年来已经清楚，用上述“魔弹”进行靶向免疫治疗仍然存在许多问题，需要新的方法产生改善的重组免疫毒素。

每种重组免疫毒素表现为某些非特异毒性，并且在足够高的浓度下损伤不表达特异靶抗原的正常细胞。免疫毒素的这种非特异毒性是免疫毒素治疗的剂量限制因素。那一种组织被非特异毒性所影响依赖于用于免疫毒素制备的具体毒素，而免疫毒素透入组织和肿瘤的能力很大程度上依据于免疫毒素的大小。

较大稳定的偶联免疫毒素在血管中长时间存在(T_1/25-15小时)，因此内皮细胞接触可以导致内皮细胞损伤的高浓度毒素。较小的分子，如快速离开血管系统的重组免疫毒素，可能具有不同的毒性。在人类中，用蓖麻蛋白和其他核糖体毒素以及假单胞菌外毒素A(PE)、白喉毒素(DT)制成的免疫毒素和它们的截短衍生物产生各种毒性。这些毒性包括血管渗漏综合症(主要是蓖麻蛋白免疫毒素)和肝脏毒性(PE衍生的免疫毒素)。蓖麻毒素A链特异地与内皮细胞结合，然后杀死这些细胞并损伤血管，可以解释在动物和人类中使用蓖麻免疫毒素时观察到的血管渗漏综合症。PE免疫毒素的非特异肝脏毒性有可能由于容易进入肝细胞和非常快速的非特异吸收和肝细胞的蛋白内在化引起。然而，也有可能除了在大多数免疫毒素中已移去的特异细胞结合位点(结构域Ⅰ)外，PE含有一个被肝细胞识别，具有低亲和力的额外位点，这是肝脏毒性的原因。

在临床应用免疫毒素中的另一个主要障碍是针对这些免疫毒素，主要是针对毒素部分的人类免疫应答。如PE和DT一样的细菌毒素是高度免疫原性的，并且不能用标准技术人源化。衍生于DT免疫毒素的使用受限制，这是因为在发达国家的许多人已进行过抗DT的免疫接种，并且许多成年人有针对DT的中和抗体。免疫原性是个问题，迄今为止仍未找到实用的解决方法。降低这些分子的免疫原性将极大地改善免疫毒素的临床应用。

免疫毒素成功应用的一个例子是消除表达高亲和力IL2受体(IL2R)的活化T细胞，而正常静止T细胞和它们的前体细胞不被清除。理论上，由IL2制备的免疫毒素能消除在各种疾病状态有关的表达IL2R白血病细胞或表达IL2R的免疫细胞，但不摧毁IL2R阴性的正常细胞，因此保留了T细胞免疫应答所需的抗原受体的全部细胞。

已经产生了一种嵌合蛋白IL2-PE40，并显示它能消除活化的T细胞(Lorberboum-Galski等，1988，美国国家科学院院报85:1922)。IL2-PE40对人、猿和鼠起源的表达IL2R的细胞系有极其强的细胞毒性。它也对ConA刺激的小鼠和大鼠脾细胞极强的细胞毒性，并且对抗原活化的小鼠细胞和淋巴细胞混合培养中细胞毒T细胞的产生有抑制作用(Lorberboum-Galski等，1988，生物化学杂志263:18650-18656；Ogata等，1988，免疫学杂志41:4224-4228；Lorberboum-Galski等，1990，生物化学杂志265:16311-16317)。