[发明专利]通过同源重组在人细胞中生产人突变蛋白

说明书

本发明涉及一种通过同源重组在真核细胞中生产真核多肽的突变蛋白的方法。本发明另外还涉及一种生产人细胞的方法，所述人细胞适合生产人突变蛋白。最后，本发明涉及通过所述方法生产的人细胞和可从其获得的突变的人蛋白质以及含这些突变蛋白的药物制剂。

重组人蛋白质的大量生产是生物技术领域中已知的。这样获得的蛋白质可用作治疗剂。通过缺失、添加或/和取代个别的氨基酸或整个肽片段生产突变的人蛋白质(它们不同于相应的天然人蛋白质)的重组生产方法也是已知的。

尤其在药物应用方面常需要在真核细胞中生产人多肽，因为与在原核细胞例如大肠埃希氏菌(E.coli)中生产的多肽相比，这些多肽被糖基化了，因而与在体内内源性地出现的多肽差别较小，于是更不常观察到不希望的副作用(例如增大的免疫原性或较差的耐受性)的出现。

以前已通过异源重组基因表达生产了突变的人蛋白质。为此，将核酸构建物引入所期望的真核细胞，该真核细胞含有在启动子和选择标记基因的控制下编码所述突变多肽的核酸序列。在该方法中，所述核酸构建物被位点非特异性地整合入所述细胞的基因组。

在该异源重组基因表达中，可能由于位点非特异性整合而经常出现不希望的、不利的过程。例如，在整合入基因组的过程中可能在编码蛋白质的序列中出现突变且尤其是缺失。此外，所述整合可能在基因组中顺式元件所处的位点上进行，该顺式元件对核酸构建物的表达控制序列有阻抑效果，结果获得的细胞重组蛋白质产率减少了。表达构建物整合入所述细胞的重要基因或者导致该细胞死亡，或者导致有机能障碍的重组细胞，它尤其会导致重组蛋白质产率的减少。

插入也能导致以这种方式获得的细胞稳定性的降低，于是在长时间后它们失去其表达重组蛋白质的能力。

因此，本发明的目的是提供一种在稳定的生产细胞中以良好的产率生产糖基化真核多肽的糖基化的方法，所述糖基化尽可能与天然蛋白的糖基化相似，所以至少部分地消除了现有技术的缺点。

该目的是按本发明通过生产真核多肽的突变蛋白的方法实现的，其中

(i)将一种能同源重组的核酸分子引入含编码内源性靶多肽的靶核酸序列的真核细胞，所述核酸分子包括：

(a)至少一段序列片段，该序列片段与所述靶核酸序列的基

因座中的序列是同源的，并且，与所述内源性靶核酸序

列相比，在成熟多肽的编码区具有突变，以及

(b)一段编码选择标记的核酸片段，

(ii)将所述细胞在使得被引入的核酸分子发生同源重组的条件下培养，于是在同源重组后该细胞含有能表达靶多肽的突变蛋白的突变靶核酸序列，

(iii)选择在其中发生了同源重组的细胞，以及

(iv)从所述细胞或/和细胞上清液分离突变蛋白。

突变的真核蛋白质(尤其是突变的人蛋白质)可通过本发明的方法在同源细胞中生产。意外地，这使得能以高产率获得具有与天然蛋白质很相似的糖基化型式的突变蛋白。本发明方法的一个优点在于，蛋白质可在真核细胞中被突变，并且通过该细胞合成的突变蛋白与内源性地出现的细胞蛋白质相似。本发明方法进一步的优点在于，生成的细胞(该细胞生产突变蛋白)的性能不因位点非特异性基因整合而被不利地改变。因此，该细胞的基因组除了待表达蛋白质的基因座以外未以任何方式改变，于是排除了相关的不利效果。

通过本发明的方法生产的人突变蛋白由于缺失、添加或/和取代个别的氨基酸或整个肽片段而不同于相应的天然蛋白质。优选生产的突变蛋白在N端和/或C端具有突变，例如缺失、插入、取代或/和与其它蛋白质(例如人蛋白质)融合。

本发明的突变蛋白优选是非天然存在的多肽，并且与待突变的多肽的等位基因变异(这在其它起始细胞中是天然出现的)不同之处在于至少一个氨基酸不同。非天然的突变蛋白特别优选地由于缺失、添加或/和插入个别的氨基酸或肽片段而不同于天然的等位基因变异。

应用于本发明方法中的细胞是任意的真核细胞，它具有待突变的靶基因的至少一个内源性拷贝。该细胞优选是人细胞，特别优选是无限增殖化人细胞，例如HeLa细胞、Namalwa细胞或HT 1080细胞。