[发明专利]通过同源重组在人细胞中生产人突变蛋白

权利要求书

1.生产真核多肽的突变蛋白的方法，

其中

(i)将一种能同源重组的核酸分子引入含编码内源性靶多肽的靶核酸序列的真核细胞，所述核酸分子包括：

(a)至少一段序列片段，该序列片段与所述靶核酸序列的基

因座中的序列是同源的，并且，与所述内源性靶核酸序

列相比，在成熟靶多肽的编码区具有突变，以及

(b)一段编码选择标记的核酸片段，

(ii)将所述细胞在使得被引入的核酸分子发生同源重组的条件下培养，于是在同源重组后该细胞含有能表达靶多肽的突变蛋白的突变靶核酸序列，

(iii)选择在其中发生了同源重组的细胞，以及

(iv)从所述细胞或/和细胞上清液分离突变蛋白。

2.权利要求1的方法，

其中

所述细胞是人细胞。

3.权利要求2的方法，

其中

所述细胞是HeLa细胞、Namalwa细胞或HT 1080细胞。

4.权利要求1～3之一的方法，

其中

应用了在复染色体上含靶核酸序列的起始细胞。

5.前述权利要求之一的方法，

其中

另外，所述靶核酸序列的表达是通过引入异源表达控制序列而激活的。

6.权利要求5的方法，

其中

所述异源表达控制序列是病毒启动子，并且特别是CMV启动子。

7.前述权利要求之一的方法，

其中

所述编码选择标记的核酸片段是新霉素磷酸转移酶基因。

8.前述权利要求之一的方法，

其中

所述被引入细胞的核酸分子另外还含一种扩增基因，并且所述突变靶核酸序列在同源重组后被扩增了。

9.权利要求8的方法，

其中

二氢叶酸还原酶基因被用作扩增基因。

10.前述权利要求之一的方法，

其中

所述靶核酸序列是组织纤溶酶原激活物(t-PA)、促红细胞生成素、胰岛素、肿瘤坏死因子、白细胞介素或白细胞介素受体序列。

11.权利要求1～9之一的方法，

其中

所述突变蛋白是得自t-PA、包括t-PA的K2域和P域的多肽。

12.前述权利要求之一的方法，

其中

所述突变蛋白是从在悬浮液中培养的细胞的上清液分离的。

13.前述权利要求之一的方法，

其中

所述突变蛋白是从在无血清培养基中培养的细胞的上清液分离的。

14.可通过权利要求1～13之一的方法从人细胞获得的突变的人多肽，其特征在于人糖基化和不存在所述种的外源多肽。

15.生产一种表达人靶多肽的突变蛋白的人细胞的方法，

其中

(i)将一种核酸分子引入含编码内源性靶多肽的靶核酸序列的人细胞，所述核酸分子包括：

(a)至少一段序列片段，该序列片段与所述靶核酸序列的基

因座中的序列是同源的，并且，与所述内源性靶核酸序

列相比，在成熟靶多肽的编码区具有突变，

(b)任选地一种所述靶核酸序列的异源表达控制序列，以及

(c)一段编码选择标记的核酸片段，

(ii)将所述细胞在使得被引入的核酸分子发生同源重组的条件下培养，于是在同源重组后该细胞含有能表达靶多肽的突变蛋白的突变靶核酸序列，

(iii)选择在其中发生了同源重组的细胞，以及

(iv)分离这样选择的细胞。

16.权利要求15的方法，

其中

所述核酸分子另外还含一种扩增基因，并且所述突变靶核酸序列在同源重组后被扩增了。

17.权利要求16的方法，

其中

二氢叶酸还原酶基因被用作扩增基因。

18.可通过权利要求15～17之一的方法获得的人细胞，它含至少一种编码突变的人多肽的内源性基因。