[发明专利]具有多拷贝目的基因和可筛选标记而不具选择性标记的产蛋白质细胞

说明书

发明领域

本发明涉及一种构建不含有插入选择性标记基因的微生物多拷贝产蛋白质细胞的方法；通过该方法可获得的微生物多拷贝产蛋白质细胞；以及使用这种微生物多拷贝产蛋白质细胞生产目的蛋白质的方法。

发明背景

本领域描述了大量制备能够表达高产量目的蛋白质的微生物菌株的方法。

这些方法通常是基于多拷贝菌株的构建，即该菌株含有多于一个拷贝的编码目的蛋白质的基因。

这些多拷贝菌株通常按如下策略构建：

1)将一段序列导入微生物细胞的染色体中，由此使该细胞染色体含有DNA结构A-P-M-A，其中

A表示同源DNA序列，

P表示编码目的蛋白质的DNA序列，

M表示编码选择性标记的DNA序列(如抗生素抗性)，

2)在对选择性标记增加的选择压力下增殖所述细胞；

3)鉴定通过同源序列A的同源重组获得了增加的抗性的细胞。

构建的多拷贝菌株然后含有结构---A-P-M-A-P-M-A-P-M-A---

专利US 4959316，US 5695976，US 5733753和WO 94/14968，描述了这些构建多拷贝菌株的方法，此外引入的参考提供了更多的细节。

发明概述

基于环境的考虑，在蛋白质工业生产中选择性标记尤其是抗生素抗性标记用于细胞中，在各种方法中不是优选的。

因此，本发明要解决的问题是提供一种在实际多拷贝分离过程中不使用任何选择性标记的多拷贝细胞构建新方法，由此提供了获得不含有插入选释性标记基因，尤其是没有插入抗生素抗性标记基因的多拷贝细胞的可能性。

问题的解决基于本发明人证实，可以使用可筛选蛋白质(screenable protein)作为标记替代本领域中已知的使用选择性蛋白质(selectable protein)作为标记来构建多拷贝菌株。

因此，本发明第一部分涉及一种构建不含有插入选择性标记基因的微生物多拷贝产蛋白质细胞的方法，包括

a)将一段序列导入微生物细胞的染色体中，由此使该细胞染色体含有DNA结构A-P-S-A，其中

A表示同源DNA序列，

P表示编码目的蛋白质的DNA序列，

S表示编码可筛选蛋白质的DNA序列

b)增殖所述细胞；

c)筛选产生增加量的选择性蛋白质的细胞；以及

c)回收c)所鉴定的细胞；以及任选地

d)使用步骤d)中回收的细胞作为起始材料重复步骤b-d。

术语“可筛选蛋白质”表示一种蛋白质不是细胞生长所必需的，即如果它被从细胞中去除，那么在类似的生长条件下，与所述细胞中包含可筛选蛋白质时相比，该细胞仍然能够以基本上相同的生长速率生长。一个合适的“可筛选蛋白质”可以是在适宜暴露下发荧光的蛋白质，比如绿色荧光蛋白质(GFP)或其变体(更多细节见下)。

这一术语是与此处定义为“选择性蛋白质”的蛋白质相对应而言的；“选择性标记蛋白质”或“选择标记蛋白质”表示一种是细胞生长所必需的蛋白质，即如果它被从细胞中去除，那么那么在类似的生长条件下，与所述细胞中包含“选择性蛋白质”相比，该细胞将不能在以基本上相同的生长速率生长。

这种“选择性标记蛋白质”通常可以是一种抗生素抗性蛋白质。因此，当一个细胞生长于含相应抗生素的培养基中时，细胞内抗生素抗性蛋白质的量可以基本上影响细胞的实际生长速率。

术语“不含有插入选择性标记基因的多拷贝产蛋白质细胞”表示一个细胞不含有在制备多拷贝产蛋白质细胞过程中被插入细胞的选择性标记基因。本领域中制备含有这种插入选择性标记基因多拷贝产蛋白质细胞的已知方法的讨论见上述“背景”部分。

术语“基因”表示编码具特异活性的多肽的DNA序列，即术语“选择性标记基因”表示编码具选择性标记活性的多肽的DNA序列。

根据本发明的方法鉴定的多拷贝细胞，通过同源序列“A”的自发同源重组在染色体中获得了增加数目的可筛选蛋白质“S”基因。

自发同源重组通常是相当稀有的事件。

然而，通过根据本发明的方法筛选合适数量的细胞(优选多于10⁵个细胞)，本发明人证实可以鉴定出这种细胞。

根据本发明所最终构建的多拷贝细胞，含有---A-P-S-A-P-S-A-P-S-A---结构，由此含有多拷贝的目的蛋白质“P”。