[发明专利]具有多拷贝目的基因和可筛选标记而不具选择性标记的产蛋白质细胞

权利要求书

1.一个构建不含有插入选择性标记基因的微生物多拷贝产蛋白质细胞的方法，包括：

a)将一段序列导入微生物细胞的染色体中，由此使该细胞染色体含有DNA结构A-P-S-A，其中

A表示同源DNA序列，

P表示编码目的蛋白质的DNA序列，

S表示编码可筛选蛋白质的DNA序列

b)增殖所述细胞；

c)筛选产生增加量的选择性蛋白质的细胞；以及

d)回收c)所鉴定的细胞；以及任选地

e)使用步骤d)中回收的细胞作为起始材料重复步骤b-d。

2.根据权利要求1的方法，其中该可筛选蛋白质是在合适暴露下发荧光的蛋白质。

3.根据权利要求2的方法，其中该发荧光蛋白质是绿色荧光蛋白(GFP)或其变种。

4.根据权利要求2或3的方法，其中的筛选步骤C)是通过使用具细胞分选能力的流式细胞计，筛选发荧光可筛选蛋白质的量增加的细胞进行的。

5.根据权利要求4的方法，其中该发荧光蛋白质是绿色荧光蛋白(GFP)或其变种，在筛选步骤中，在合适的暴露下使GFP或其变种发出荧光。

6.根据权利要求1-5的任意方法，其中该微生物细胞是细菌细胞。

7.根据权利要求6的方法，其中的细菌细胞是芽孢杆菌(Bacillus)属的细胞，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophus)，嗜碱芽孢杆菌(Baci′lusalkalophlus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)，灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，幽闭芽孢杆菌(Bacillus clausii)或地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifomis)的细胞。

8.前述任何权利要求的方法，其中该目的蛋白质是一种酶，特别是蛋白质酶，脂酶，淀粉酶，半乳糖苷酶，支链淀粉酶，纤维素酶，葡萄糖异构酶，蛋白质二硫键异构酶，环化糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，cyclodextrin gluconotransferase)，肌醇六磷酸酶，葡萄糖氧化酶，葡糖基转移酶，漆酶，或木聚糖酶。

9.根据权利要求1-8任何方法可获得的微生物多拷贝产蛋白质细胞，其特征是该细胞含有多个拷贝表达目的蛋白质(“P”)的基因和多个拷贝表达可筛选蛋白质(“S”)的基因。

10.在微生物细胞中产生至少一个目的蛋白质的方法，这一方法包括：

(i)在允许目的蛋白质产生的条件下培养根据权利要求9的微生物多拷贝产蛋白质细胞；以及

(ii)从获得的培养液或微生物的多拷贝产蛋白质细胞中回收该目的蛋白质。