[发明专利]将基因整合至哺乳动物细胞特定位点的方法及所用载体

说明书

发明领域

本发明涉及将所需外源DNA靶向整合至哺乳动物细胞基因组内的特定位置的方法，本发明更具体地描述了鉴定哺乳动物基因组中的转录活性靶位点(“热点”)并经同源重组将所需DNA插入此位点的新方法。通过使可扩增的选择性标记，如DHFR与外源DNA一起共整合，本发明还任选提供了此位置处所需DNA的基因扩增能力。本发明还描述了适于实现上述目的的新载体的构建，还提供了通过上述方法产生的哺乳动物细胞系，此细胞系含有整合至靶热点的所需外源DNA。

背景

在原核和真核生物体中表达重组蛋白的技术已发展成熟。哺乳动物细胞在蛋白质生产方面明显优于细菌或酵母，原因在于它们能正确装配，糖基化和翻译后修饰重组表达的蛋白质。转染至宿主细胞之后，重组表达构建体可作为染色体外的元件存在，或整合至宿主细胞基因组中。稳定转染的哺乳动物细胞系的产生通常包括下列步骤：将编码所需基因以及药物抗性基因(显性选择性标记)的DNA构建体导入宿主细胞，随后在药物的存在下培养以选择已成功整合外源DNA的细胞。在很多场合下，所需基因与随后可被基因扩增的药物抗性选择性标记相连。编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因是最常用的标记基因。在DHFR的竞争性抑制剂氨甲碟呤的存在下培养细胞会因DHFR基因的扩增导致DHFR的产量增加。由于DNA的侧翼区也可被扩增，经感染的细胞系中与DHFR相连基因的共扩增会导致蛋白质产量增加，从而导致所需基因的高水平表达。

尽管此方法经证明是成功的，但因整合事件的随机性使得该系统中仍存在很多问题。这些问题存在的原因是基因座处的局部基因环境的作用会大大影响表达水平，此现象在文献中有详细记载，一般称之为“位置效应”(例见Al-Shawi等，分子细胞生物学，10：1192-1198(1990)；Yoshimura等，分子细胞生物学，7：1296-1299(1987))。由于绝大多数哺乳动物DNA处于无转录活性的状态，随机整合法无法控制整合DNA的转录状况，结果，因整合位点的不同，整合基因的表达水平差异很大。例如，外源DNA整合至基因组的无活性或转录“沉默”区会导致很少或不表达。而与之形成对照的是，整合至转录活性位点会导致高表达。

因此，当工作目标是得到高水平的基因表达时，这也是基因工程方法典型的所需结果，一般必需筛选大量转染子以找到这种高产量的克隆。另外，外源DNA随机整合至基因组在某些情况下会破坏重要的细胞基因，导致表型改变。这些因素使高表达的稳定哺乳动物细胞系的产生变得复杂和费力。

最近，我们实验室描述了含有翻译受损显性选择性标记的DNA载体在哺乳动物基因表达中的使用(公开于1993年11月3日提交的美国流水号08/147,696，最近已授权)。

这些载体含有翻译受损的新霉素磷酸转移酶(neo)基因作为显性选择性标记，经人工改造后含有内含子，其中插入了DHFR基因以及一个或多个所需基因。我们发现相对于常规哺乳动物表达载体而言，将这些载体用作表达构建体可显著降低所产生的药物抗性集落的总数，从而便于进行筛选。另外，使用此系统得到的较高比例的克隆是高表达克隆。这些结果明显归功于对neo选择性标记所作的修饰。由于neo基因的翻译受损，被转染的细胞不能产生足够的neo蛋白以在药物选择中存活，从而使药物抗性集落的总数减少。另外，较高百分比的存活克隆含有整合至基因组位点的表达载体，该位点处基础转录水平高，导致neo过量产生，从而使细胞能克服neo基因受损所带来的问题。同时，与neo相连的所需基因也会类似地提高转录水平。neo内产生人工内含子的结果使这一相同的优点也是真实的；存活取决于功能性neo基因的合成，而neo基因的合成反过来又取决于neo内含子正确和有效的剪接。另外，如果载体DNA被整合至已具有高转录活性的区域则更有可能符合这些标准。

载体整合至转录活性区域之后，通过DHFR基因选择进行基因扩增。使用此系统，可以得到使用低水平氨甲碟呤(50nM)选择的克隆，所述克隆含有几(＜10)拷贝分泌高水平蛋白质(＞55pg/细胞/天)的载体。另外，可以在相对较短的时间内获得上述克隆。然而，扩增的成功是可变的。一些转录活性位点不能被扩增，因此，由特定位点扩增的频率和程度是不可预测的。

总的说来，相对于随机整合的其它方法而言，使用这些翻译受损的载体的方法有显著改善。然而，如上所述，对整合位点缺乏控制的问题仍然是显著的。