[发明专利]菠萝蛋白酶成分

说明书

本发明涉及一种作为菠萝蛋白酶成分的蛋白。具体地，本发明涉及负责菠萝蛋白酶抗癌活性并也具有作为免疫调节剂和抗微生物剂的活性的蛋白。

菠萝蛋白酶(菠萝蛋白酶)是在凤梨科植物组织中发现的蛋白水解酶的统称。尽管水果中菠萝蛋白酶已知，但是菠萝蛋白酶最常见的形式是来自凤梨植物(Ananas comosus)茎的各种成分的混合物。已知茎中菠萝蛋白酶(此后称为菠萝蛋白酶)包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶；它也可包含淀粉酶和纤维素酶活性。另外，也存在多种其它成分。

菠萝蛋白酶曾用于治疗多种病症包括炎症，具体地，它已用于治疗腹泻。菠萝蛋白酶在治疗感染性腹泻方面的用途在WO-A-9301800中得到，其中证明菠萝蛋白酶通过蛋白水解作用破坏病原体的肠道受体从而发挥作用，在WO-A-8801506中，认为菠萝蛋白酶使病原体从肠道受体上脱离下来。

Taussig等，Planta Medica，1985，538-539和Maurer等，PlantaMedica，1988，377-381都提出菠萝蛋白酶可用于抑制肿瘤生长。US 5,233,406、DE-A-4302060和JP-A-59225122也说明了菠萝蛋白酶在治疗癌症方面的用途。US 5,223,406认为菠萝蛋白酶能够诱导肿瘤坏死因子(TNF)，而DE-A-4302060认为菠萝蛋白酶能够通过肿瘤表面蛋白CD44的结构修饰防止转移。

在WO-A-9400147中描述了各种实验，这些实验证明蛋白水解酶，尤其是菠萝蛋白酶能抑制分泌。此申请也公开了菠萝蛋白酶能降低毒素结合活性并能抑制诸如热不稳定毒素(LT)和霍乱毒素(CT)的毒素及诸如热稳定毒素(ST)的毒素的分泌效应。这些观察结果通过菠萝蛋白酶混合物的一个成分茎菠萝蛋白酶看来能调节环核苷酸途径这一事实得到解释，并且这一点在WO-A-9500169中得到进一步讨论。另外，也证明菠萝蛋白酶抑制由钙依赖的途径导致的分泌。

WO-A-9600082也涉及了菠萝蛋白酶并且公开了粗制菠萝蛋白酶能够干涉对生长重要的信号传导途径，尤其是导致生长因子如白细胞介素-2(IL-2)、血小板衍生的生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子(IGF)产生的信号传导途径。此文献认为作为其封闭信号传导途径的能力的结果，菠萝蛋白酶能作用为抗癌剂。另外，依据要处理的细胞类型以及细胞以前是否已活化，菠萝蛋白酶可用作免疫抑制剂或免疫刺激剂。

从现有技术看，菠萝蛋白酶很明显是具有多种不同生理效应的混合物。并不是所有的菠萝蛋白酶组分都已得到鉴定，因此除了我们已描述了其活性的茎菠萝蛋白酶，还不清楚哪一个成分负责菠萝蛋白酶各种不同效应的哪一种。如果菠萝蛋白酶混合物要用作药物，这当然是主要缺点，因为尽管菠萝蛋白酶的一个成分可能产生希望的效果，菠萝蛋白酶混合物的某些其它成分的作用可能产生不利的副作用。

因此，如果产生特定医学活性的菠萝蛋白酶单独成分可以得到分离并且单独施用以便减少副作用的可能性，这将是有益的。

本发明已分离、纯化和鉴定了一个这样的菠萝蛋白酶成分，它与混合物的其它已知成分不同，并且已发现它具有抗癌性。

在本发明的第一方面，提供了作为菠萝蛋白酶成分的蛋白，具有由SDS-PAGE测定的约22.2-25.08kDa的分子量，并具有等电点3.8-4.79，且具有如下氨基末端序列：Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Asn Glu Val Lys Asn(SEQ ID NO：1)并且，另外还包含以下序列：

Gly Gly Trp Glu Phe Lys(SEQ ID NO：2)

Lys Ala Val Asn Gly(SEQ ID NO：3)

Tyr Trp Ile Val Arg(SEQ ID NO：4)

Asn Ser Trp Gly Ser Ser Trp Gly Glu Gly Gly Tyr Val Arg(SEQ ID NO：5)

Thr Ser Leu Asn His Ala Ile Thr Ile Ile Val Tyr(SEQ ID NO：6)

Leu Pro Glu Phe (Gln) Pro (Gln) Val Leu Asp-Ala-(SEQ ID NO：7)

Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Ala Cys Gly Ile Ala Met Ser Pro Leu-Thr-