[发明专利]有蹄动物胚胎干样细胞、制法及用该细胞产生转基因的有蹄动物的方法

说明书

发明领域

本发明主要涉及的领域是未分化细胞和产生这类细胞的方法。更具体地，本发明涉及多能性有蹄动物(ungulate)细胞，尤其是猪细胞，还涉及用这类细胞产生的转基因的和嵌合的有蹄动物。

发明背景

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)首先是用鼠成纤维细胞的饲养层或含水牛鼠(buffalo rat)肝细胞的条件培养基。从鼠胚胎中培养出的。用鼠胚胎建立的ES细胞系，其特征性的表型包括：细胞核大，核仁明显和细胞质较少。采用合适的培养条件时，这些细胞可以相对无限地生长。通过使用维甲酸或自发地去除饲养层或条件(conditioned)培养基，可以在体外诱导它们分化。此外，这些细胞可以被注射到鼠胚泡中，形成体细胞嵌合体或种系嵌合体。这后一种特性使得鼠ES细胞可被用于产生具有基因组特定变化的转基因鼠。参见M.Evans等人，“自然”，292,154(1981)；G.Martin，＂美国科学院院报＂78,7638(1981)；A.Smith等人，＂发育生物学＂(Developmental Biology)121,1(1987)；T.Doetschman等人，＂发育生物学＂(Developmental Biology)127,224(1988)；A.Handyside等人，＂Roux′s Arch Dev.Biol″198,48(1989)。

使鼠胚胎干细胞能被培养的活性物质已经被鉴别为分化抑制活性物质(differentiation inhibiting activity,DIA)，也被称为白血病抑制因子(LIF)。参见A.Smith,＂J.Tiss.Cult.Meth＂.13,89(1991)；J.Nichols等人，＂Development″110,1341(1990)。可使用重组形式的LIF，从而从鼠胚胎中获得ES细胞。参见S.Pease等人，＂发育生物学＂(Developmental Biology)141,344(1990)。还请参见1992年11月24日授权给Williams等人的美国专利No.5,166,065。

在小鼠胚胎的研究工作之后，有几个研究小组尝试开发羊、猪和牛的干细胞系。一些报道表明，使用类似用于小鼠的培养条件，已从猪胚胎中培养出具有干细胞样(stem cell-like)外表的细胞系。参见M.Evans等人，PCT申请WO90/03432；E.Notarianni等人，＂J.Reprod.Fert.,Suppl.″41,51(1990)；J.Piedrahita等人，＂Theriogenology″34,879(1990)；E.Notarianni等人，＂Proceedngs ofthe 4th WorldCongress on Genetics Applied to Livestock Products＂,58(Edinburgh,July 1990)。

已尝试培养来自鸟类胚胎的胚胎干细胞。但没有经病毒或化学转化，是难以建立连续的鸡细胞系，而且大多数原代鸡细胞系不能存活超过2-3个月。培养来自未孵育(unincubated)胚胎的细胞是困难的，而且在所报道的条件下这些细胞不能存活超过2周。参见E.Mitrani等人，＂Differentiation″21,56-61(1982)；E.Sanders等人，＂细胞组织研究＂(Cell Tissue Res.)220,539(1981)。

在美国专利5,340,740中，Petille等人在条件培养基存在下，于小鼠饲养层上培养鸡的胚胎细胞，并获得了培养的干细胞。

胚胎干细胞(ES细胞)是胚泡的多能性派生物，它能在体外被培养和操作，然后再返回到胚胎环境中，并通常可形成包括种系在内的所有组织(可参见Robertson,E.G.(1986)＂Trends in Genetics″2:9-13)。体外繁殖的ES细胞不仅能够有效地形成嵌合体(包括种系嵌合体)，而且这些细胞能够在体外进行操作而不会丧失其形成种系嵌合体的能力(Robertson,E.J．等人，(1986)＂自然＂323∶445-447)。