[发明专利]有蹄动物胚胎干样细胞、制法及用该细胞产生转基因的有蹄动物的方法

权利要求书

1．一种生产未分化的、具有胚胎干细胞表型的有蹄动物细胞的持续培养物的方法，其特征在于，它包括：

从有蹄动物胚胎中收集原生殖细胞；

培养该生殖细胞超过30天；

从培养的生殖细胞中选择出与猪胚胎干细胞相象并表现出胚胎干细胞表型的细胞。

2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：

从收集的生殖细胞中预选择那些碱性磷酸酶活性为阳性的细胞；

其中该原生殖细胞是从选自下组的胚胎的背侧肠系膜或性腺嵴中收集的：22-28天的猪胚胎，和34-40天的牛胚胎。

3．如权利要求2所述的方法，其特征在于，该培养是在含5％±2％二氧化碳的空气，温度为39℃±3℃，使用含15％(v/v)胎牛血清和1mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改进的Eagles培养基，在失活的STO细胞上进行；

其中有蹄动物胚胎是25天±1天的猪胚胎；

而且其中该方法形成超过1000个具有胚胎干细胞表型的猪胚胎干细胞；

且选出的具有胚胎干细胞表型的细胞在该STO细胞上培养时，可维持该表型120天。

4．一种持续的有蹄动物细胞培养物，它是具有胚胎干细胞表型的未分化的有蹄动物细胞，该细胞来自有蹄动物胚胎的性腺嵴；

其中所述细胞是猪细胞，而且培养物中含有超过2000个具有胚胎干细胞表型的猪胚胎干细胞。

5．一种制备嵌合的有蹄动物的方法，其特征在于，它包括：

(a)将衍生自生殖细胞、具有胚胎干细胞表型并具有第一遗传互补体的有蹄动物细胞，引入与生殖细胞相同物种的受体胚胎中，该受体具有第二遗传互补体，从而形成嵌合的有蹄动物胚胎，

(b)将嵌合的有蹄动物胚胎置于适合完成发育过程的环境中，从而形成嵌合的有蹄动物。

6．如权利要求11所述的方法，其特征在于，该细胞被引入处于植入前阶段如胚泡阶段的胚胎中；

其中，第一遗传互补体与第二遗传互补体不同，

其中，第一遗传互补体包括：稳定地整合入具有胚胎干细胞表型的细胞的遗传互补体中的外源核苷酸序列。

7．如权利要求6所述的方法，其特征在于，该第一遗传互补体包括编码选自下组蛋白质的外源核苷酸序列：以可回收形式和数量表达的人因子Ⅸ、人血液蛋白、人激素、人生长因子、人细胞因子、人酶、人激素受体、人结合蛋白、抗原、翻译因子、转录因子、癌蛋白、原癌蛋白、人奶蛋白质、人肌肉蛋白。

8．如权利要求6所述的方法，其特征在于，该第一遗传互补体包括编码选自下组蛋白质的猪核苷酸序列：改善猪畜体组成、猪畜体重量、猪疾病抗性和猪奶产量的蛋白。

9．一种转基因的有蹄动物，其特征在于，它是用包括下列步骤的方法产生的：

(a)从有蹄动物胚胎的性腺嵴中收集原生殖细胞；

(b)培养该生殖细胞超过30天；

(c)从培养的细胞中，选择出与有蹄动物胚胎干细胞相象并表现出胚胎干细胞表型的培养的生殖细胞；

(d)将外源DNA引入培养的生殖细胞；

(e)将步骤(d)的细胞引入处于植入前阶段的受体胚胎；和

(f)将步骤(e)的胚胎引入适合完成发育的环境，形成转基因的有蹄动物。

10．如权利要求9所述的转基因的有蹄动物，其特征在于，该有蹄动物是与步骤(f)的转基因有蹄动物交配而得的子代。