[发明专利]重组人淋巴毒素α衍生物a的构建与纯化工艺

说明书

本发明涉及重组人淋巴毒素α衍生物a构建及其生物工程制备方法。

淋巴毒素α(简称LTα)是淋巴细胞激活后产生的一种淋巴因子。它和肿瘤坏死因子α(简称TNFα)是哺乳动物体内迄今发现的细胞因子中对病毒感染细胞和肿瘤细胞有直接杀伤作用的仅有的两个。它们在基因结构、生物学功能上有许多相似之处，所以有人又称LTα为TNFβ。近几年的研究发现两者之间也有许多不同之处，例如：

                 TNFα         LTα

体内主要来源   巨噬细胞      淋巴细胞

体内半衰期     20分钟        几天

膜结合方式     信号肽        LTβ

受体           TNF RⅠ、Ⅱ   TNF RⅠ、Ⅱ和LTβR

活性形式       同源三聚体    同源三聚体、

                             LTα1LTβ2、LTα2LTβ1基因剔除小鼠表现 对细菌感染敏感 外周淋巴组织不发育

自1984年人LTαcDNA被克隆、细菌表达以来，由于重组产物不溶给分离纯化带来极大困难，影响了它的应用开发。试剂级重组LTα也是近几年才上市的，价格比TNFα贵。近两年动物试验结果表明TNFα和LTα在同样剂量下对某些肿瘤生长抑制的效果几乎相仿，但毒性作用LTα比TNFα低，两者抑瘤谱也不完全一致(LTβ受体)，LTα的体内半衰期比TNFα长许多，因此有希望成为肿瘤治疗的药物。

本发明的目的在于提供一种重组人淋巴毒素α衍生物及其纯化工艺，以便进一步开发成毒副作用低、治疗效果好的抗肿瘤药物。

人淋巴毒素α(hLTα)活性形式是三聚体，单体由171个氨基酸组成，分子量为18.8kDa左右。hLTα的N端对其活性不重要，而且编码hLTαN端氨基酸的核苷酸序列大大影响hLTαcDNA在细菌里的表达效率。国外根据大肠杆菌偏爱密码子全合成hLTαcDNA或合成N端十几个氨基酸的核苷酸序列再与hLTαcDNA剩余部分拼接来实现rhLTα的细菌表达。

本发明根据hLTα融合蛋白能在细菌里高表达和N端氨基酸对hLTα生物学活性不重要的结论，构建了一种重组人淋巴毒素α衍生物a(生物学符号为rhLTαDa)，它是由改变人淋巴毒素α(hLTα)一级结构而得到的一种淋巴因子，该淋巴因子N端缺失27个氨基酸，包括附加上的第一个甲硫氨酸共145个氨基酸，分子量为15kD左右。

构建本发明的rhLTαDa，包括从人基因文库中克隆人淋巴毒素α(hLTα)基因，从人T细胞cDNA文库PCR(聚合酶链式反应)扩增得到编码人淋巴毒素α成熟蛋白的cDNA和引物设计、克隆、表达重组人淋巴毒素α衍生物a，其中，

1)编码人淋巴毒素α(hLTα)成熟蛋白的cDNA核苷酸序列中第26位氨基酸是Thr(ACC)，不同于其它文献报道中的Asn(AAC)；

2)PCR扩增重组人淋巴毒素α衍生物a(rhLTαDa)cDNA的引物设计如下：

                         aa29           aa33 aa34N端引物：5’ACA CAT ATG AAA CCG GCT GCT CAC CTG ATC GGA(33 mer)        NdcI        (T)             (C) (T)C端引物：5’CCG AAT TCT ACA GAG CGA AGG CTC CAA AG(29 mer)        EcoRI

rhLTαDa cDNA与hLTα原型比较，其特点是N端缺失27个氨基酸，加上一个甲硫氨酸密码子，第29位、33位和34位氨基酸的密码子改为大肠杆菌偏爱的密码子。N端引物下方括号内的碱基为原密码子。

PCR扩增的模板来自我们从人T细胞cDNA文库克隆得到编码hLTα成熟蛋白的cDNA。几个PCR产物克隆的核苷酸序列分析都表明第26位的氨基酸是Thr密码子为ACC，和文献报道的Asn(AAC)比较有一个核苷酸的差别。

hLTαDa cDNA经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC118N转化DH5α受体菌，抽提重组质粒作核苷酸序列分析，结果与设计要求符合。