[发明专利]新型结冰控制分子及其应用

说明书

本申请是根据美国专利申请号为Nos.08/413/370，30/03/1995提交的和申请号为08/485,185，07/06/1996提交的整个文本作为参照的PCT申请。

发明背景

冰的形成对有生命系统和食物产品有破坏性，对于必须对付生活环境中冰雪的人类来说，又是一种讨厌的东西和危害。本发明所属领域提供一种制备特殊化学试剂的方法，该试剂称为冰界面掺杂剂(IID)，它能有效地减少冰的形成，使即使形成的冰对有生命系统和食物无害，并因此减少对处在该环境下的人和机器造成的麻烦和危害。

参照图1，冰结晶的形状为六角形片状10。由a轴12和b轴14(它在结晶学上与a轴是等同的)形成并与c轴垂直的一个平面是一六角形截面，称为底面18。此六角体的六个面称为棱柱侧面20。结晶学上，底面18称为0001面，棱柱侧面根据方向不同称为l100面或l120面。

图2表明同样形成这种宏观结构的晶体单元也是六角体形状。在图2中，按照惯例，只表示氧原子。氢原子排列在将每一氧原子与其最近四个氧原子连接的直线上。

图2A表示如上所见的底面0001面。在每一六角形中，三个顶点向上(即向前)突出，其间的三个顶点向下(即向后)突出。向上的顶点隔开4.5埃±.02埃，相互之间角度为60°。它们的第四根键垂直突出纸面指向观者。晶格中间隔的氧原子双层21隔开的距离为7.36埃，换言之，每一由氧界定的六角形和与其紧密相邻的同样六角形隔开距离为7.36埃。图2B表示cl100和d1120棱柱侧面(晶面)的示图。

有一些天然存在的分子可改变冰和水的性质。一些鱼类产生的抗冻糖蛋白(AFGP)和抗冻蛋白或抗冻多肽(AFPs)被认为能优先吸附到冰的棱柱侧面20上，因此能阻止垂直于棱柱侧面的冰晶生长，即沿底面18和沿a轴12和b轴14方向伸展的冰晶生长。

这类鱼的这一功能足以使它能在体温比鱼的体液热力学凝固点低1℃时生存。由于这类鱼组织和体液内存在的AFGP能阻止冰的生长(即使是在过冷条件下)，因此这类鱼能与冰晶接触，并对其吸收，不致受到冰生长透过鱼过冷组织产生的侵害，这些被吸收的冰晶本可为冰生长提供成核位点。昆虫的抗冻或“热滞后”蛋白(THPs)更有效，其在低于热力学凝固点2℃或更大的过冷度条件下仍能起作用。

在极带鱼和一些陆生昆虫体内发现的天然“抗冻”或“热滞后”蛋白被认为因与晶格匹配而吸附到冰上(Davies和Hew，FASEB J.，4；2460-2468，1990)或通过沿某些轴的偶极相互作用而吸附在冰上(Yang，Sax，Chakrabartty和Hew，自然(Nature)，333：232-237，1988)。

在某些生物体内发现的抗冻糖蛋白(AFGP)和抗冻蛋白或抗冻多肽(AFPs)为新型人造IID的概念提供了天然的“原理证据”。然而，天然冰界面掺杂蛋白的活性对于大多实际应用来说尚嫌不足。而且，底面生长抑制的一个缺点是，当过冷度足以克服冰晶生长抑制时，生长通常主要是发生在垂直于底面18的c轴16方向上。这导致纺锤形或针形的冰晶形成(图1B)，显然由于机械原因，其对生命细胞造成的危害比普通的冰大。

在商业上可以实际应用的天然IID的数量和种类非常有限。而且，它们必须有相当高的的相对分子质量(通常至少约5,000道尔顿)才能有效。这使它们非常昂贵，而且它们通常需要与其它难以获得的蛋白质发生复杂的相互作用，并需要部分碳水化合物才能充分有效。

而且，将天然鱼的AFGP加入到防冻剂浓溶液中(30-40％v/v DMSO)，其对在-20℃至-40℃以下冰晶生长速度的影响很小(Fahyz，G.M.在生物冰成核及其应用(Biological Ice Nucleation and its Applitions)，18章，pp.315-336，1995)，因此对要冷藏器官玻璃化用途是否有效还有疑问。

天然抗冻蛋白的另一问题，是关于其作用的确切机理的理解一直尚不清楚，阻碍了更为有效的重组变异体的发展。最近，Warren和其同事们报道了这一方面的一些进展(美国专利No.5,118,792)。