[发明专利]在人肝癌细胞特异表达的自主复制型载体及其用途

说明书

本发明涉及一种在人肝癌细胞特异表达的自主复制型载体及其用途，特别涉及外源基因表达为人甲胎蛋白基因上游启动子、增强子所控制的，利用EB病毒质粒型复制元件构建的真核表达质粒载体及其用途。

EB病毒属于疱疹病毒科，它体内可感染人B细胞，同时体外能转化人B细胞使之永生化，在EB病毒转化细胞中，病毒一般呈隐性感染状态，病毒DNA以闭合环状游离于细胞染色体外自主复制，与宿主染色体DNA复制同步，目前已明确EB病毒质粒型复制仅依赖病毒基因组的两段序列元件，起顺式作用的质粒型复制起始区OriP和反式蛋白EBNA—Ⅰ的编码区段，总长度不及病毒基因组的三十分之一。在大肠杆菌质粒中引人EB病毒基因组的这两段序列元件，可构成一个既能在大肠杆菌中扩增，又能在人细胞自主复制的穿梭载体，它能以较高的转染频率导入人细胞表达和复制，同时插入高达几十kb的外源基因也不影响其附加子特性。(Yates，J．et al：Stable replication Of plasmids derived from Epstein—Barr Virus in variousmammalian cells．Nature 313：812)，目前这种含EB病毒复制子的真核质粒多用于真核表达文库的构建及目标基因的表达上并已有商品化试剂供应，CLONTECH labortories，Inc．的pDR2(#6167—1)就是其中之一，外源基因的表达受组成型的启动子劳氏肉瘤病毒(Rous carcoma virus)的长末端控制，没有组织特异性。

基因治疗的兴起对肿瘤的治疗提出了新的思路。其中有选择性往肿瘤细胞导入如核酸水解酶、HSV—1胸苷激酶基因等所谓自杀基因，这些基因的表达会导致被导入细胞的死亡，这种工作往往是将自杀基因置于一种肿瘤细胞特异的启动子控制之下，使基因在肿瘤细胞中特异表达而不影响正常细胞的功能。

目前已确定甲胎蛋白基因的调控序列时具有肝癌细胞表达专一性的启动子，甲胎蛋白是人胚胎期的主要血清蛋白，是由胎肝细胞分泌产生的。在成熟期肝细胞分泌甲胎蛋白的能力已消失，但在原发性肝癌的患者，甲胎蛋白发生异常表达，患者血清中检出甲胎蛋白是判断肝肿瘤发生的依据之一。研究已表明控制甲胎蛋白表达的产生是其基因上游的启动子和增强子序列，(Watanabe，K．et a1．，Cell—specific enhancer activity in a far upsteamregion of the human _α—fetoprotein gene，J Biol Chem，1987，262：4812—4819)，相信是细胞发生癌变时，低分化或不分化的肝癌细胞中，与甲胎蛋白表达有关的一些反式因子的表达激活了甲胎蛋白基因上游的启动子与增强子所致。Hubber等将甲胎蛋白调控序列克隆于逆转录病毒载体，将嵌合了甲胎蛋白上游调控区的外源基因导入表达甲胎蛋白的肝癌组织则获蛋白活性，而导入正常肝细胞则不表达(Huber，B．E．et al．，Retroviral mediatedgene therapy for the traetment of hepatocellular Carcinoma：A innovativeapproach for carcer gene therapy，Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：8039—8043)。但逆转录病毒介导基因转移的表达和复制需将基因整合到细胞的染色体以及重组病毒直接用于人体等，都存在着安全性问题，同时获得高滴度的重组病毒并非易事，制备重组病毒需将重组病毒载体转染包装细胞产生重组病毒颗粒，并需浓缩和纯化，过程相对繁琐。

本发明的目的是提供一种新型的肝细胞特异表达载体，它可以非病毒感染的形式将外源基因导入体内复制和表达，具有比直接使用逆转录病毒颗粒进行转导更高的安全性。其特点是被导入肝细胞的外源基因不与染色体发生整合行为，游离于染色体外稳定存在并自主复制，它作为一种大肠杆菌、人细胞穿梭质粒可在大肠杆菌大量扩增，经简单的纯化就可应用于肝细胞受体介导的基因转移技术，能以如常规给药的方式特异地将外源基因导入肝细胞并仅在表达甲胎蛋白的肝癌细胞才发生特异表达。

本发明的肝癌细胞特异表达的自主复制型载体pEBAF(寄存于大肠杆菌DH5α株，含该质粒的菌种命名为Escherichia coli DH5_α／pEBAF，已于1996年2月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号为CGMCC NO．0255)，见附图1，由下列DNA元件组成：