[发明专利]2－酮－L－古洛糖酸的生产方法

说明书

技术领域

本发明是涉及通过基因工程技术简便、有效地生产L-抗坏血酸前体-2-酮-L-古洛糖酸(此后也称为2KLGA)的方法。

本发明还涉及有效生产2-酮-L-古洛糖酸所运用的一系列表达体系。

发明背景

2-酮-L-古洛糖酸是合成L-抗坏血酸的一个关键性中间体。在工业生产中，2-酮-L-古洛糖酸是根据Reichstein’s方法由D-山梨糖醇氧化而化学合成的。已经知道包括葡萄糖酸杆菌属在内的多种微生物都能通过酶促氧化反应将D-山梨糖醇转化为2-酮-L-古洛糖酸。并且葡萄糖酸杆菌属的微生物，通过采用接合转移及转座子的基因工程技术加以改良。然而这类微生物的2-酮-L-古洛糖酸的产量很低，所以一直无法在工业生产中运用它们。

有鉴于此，寻找到一个高效、简便的方法来生产2-酮-L-古洛糖酸是人们迫切的愿望。

众所周知，在微生物产生诸如2-酮-L-古洛糖酸等二级代谢产物时，仅在质粒中插入能对某物质进行生物合成的一个基因(组)并培养用该质粒重组转染的微生物细胞体，并不一定就能增加所欲获得产物的产量，相反却有可能导致产量的下降[Thomas,D.I.et al.,J.Gen.alicrol.,137,pp.2331-2337(1991)]。

发明内容

本发明的目的是提供含有编码L-山梨糖脱氢酶(此后称为SDH)及编码L-山梨糖醛酮脱氢酶双方DNA的表达载体，用所述的表达载体转化的可由D-山梨糖醇高产2KLGA的转化体，以及通过培养该转化体高效、简便生产2-酮-L-古洛糖酸的生产方法。

为了达到上述提及的目标，发明者进行了大量深入的研究，并获得了具备上述优化性质的表达载体，并进一步发现2-酮-L-古洛糖酸可以通过一系列培养体系由D-山梨糖醇高效制备。这些过程包括将上述表达载体导入高效L-山梨糖且2-酮-L-古洛糖酸降解活性低的微生物宿主体中，或将其导入除上述提及特性外同时具有L-艾杜糖酸产出活性较低的微生物宿主中，本发明的全部过程即如此。

因此，本发明涉及含有编码山梨糖脱氢酶DNA(此后称为SDH基因)及编码山梨糖醛酸DNA(此后称为SNDH基因)的表达载体。

本发明还涉及由D-山梨糖醇高效生产L-山梨糖及无或低的2-酮-L-古洛糖酸降解活性的微生物，或除具备上述特性同时又无或仅具备低的L-艾杜糖酸产出活性的微生物。该微生物是在将上述表达载体导入时非常有用的宿主。本发明的表达载体不仅包括具备SDH基因和SNDH基因的载体，也包括具有各自基因的一组载体。

本发明也涉及已导入了上述表达载体的微生物转化体，它能由D-山梨糖醇高产2KLGA。

另外，本发明涉及生产2KLGA的生产方法，包括在含D-山梨糖醇的培养基中培养上述转化体并由此获得2KLGA为特征的方法。

此外本发明涉及通过遗传重组方法由D-山梨糖醇高效、简易地生产2KLGA所用的表达载体、宿主、质粒及转化方法。

附图的简要说明图1是质粒pUC18SD180的限制酶切图谱图2是质粒pUC19SD5的限制酶切图谱图3是质粒pF2、pF3及pF4的限制酶切图谱图4显示穿梭载体pFG5B的构建图5显示穿梭载体pFG14A的构建图6显示穿梭载体pFG15A的构建图7是质粒pSD5-RIBg的酶切图谱图8显示表达载体pSDH145的构建图9显示表达载体pSDH155的构建图10显示表达载体pSD33的构建图11显示表达载体pSD34的构建图12显示表达载体pSDH155-NC的构建图13显示表达载体pSDH155-NN的构建图14显示表达载体pSDH165-NN的构建图15显示表达载体pSDH-tufB1的构建

发明的详细说明(1)表达载体

本发明的表达载体同时含有编码SDH基因的DNA及编码SNDH基因的DNA。

本发明的表达载体是整合有处于表达状态的SDH基因及SNDH基因的DNA分子，并包含能在宿主微生物体中自主复制或能够整合进入宿主微生物基因组中的任何载体。

优选的表达载体是可由D-山梨糖醇高产L-山梨糖，且无2-酮-L-古洛糖酸降解活性或活性低的宿主微生物，以及除了具备上述特性，还无L-艾杜糖酸产出活性或活性低的宿主微生物，使其成为具有由D-山梨糖醇高产2KLGA为特性的微生物，并使其成为适合转化的表达载体。