[发明专利]雷怕霉素检测法

说明书

本发明涉及雷怕霉素及其衍生物的单克隆抗体，它们可用于例如检测血药浓度的检测试剂盒中。

雷怕霉素是由吸水链霉菌产生的大环内酯抗菌素，有广泛的制药学用途，尤其可作为一种免疫抑制剂，例如可应用于治疗和预防器官移植排斥和自身免疫疾病。但是，雷怕霉素在大剂量时会有副作用，并且它的生物利用度在一定程度上可变。在用雷怕霉素治疗的病人中，为了能够及时调整剂量以保持有足够药理作用的最低雷怕霉素含量，以及避免副作用产生的任何过度危害，监测患者血液中雷怕霉素浓度就变得尤为重要。但在临床中缺少能够快速简易操作的灵敏、可靠的检测方法，仍是目前雷怕霉素药物研究的一个主要障碍。

以前有关临床检测雷怕霉素的检测试剂盒的研究都不太成功。例如，EP 041795描述了一种微生物学检测法，其中雷怕霉素浓度由其抗真菌活性函数来测定。WO 92/02946提供了一种间接测定雷怕霉素的检测系统，即测定其与嗜巨噬因子(macrophilin)间的竞争结合。这两种测定方法都繁琐且不太灵敏。更重要的是，实验条件稍有不同，这两种方法的结果都会有很大变化，难以在不同医院间进行实验结果的比较。

在此之前还没有关于识别雷怕霉素的单克隆抗体的报导。由于雷怕霉素不是致免疫的，而且它自身是极强的免疫抑制剂，因此制备雷怕霉素的单克隆抗体非常困难。此外，由于在文献中雷怕霉素的代谢产物没有明显的特征，因此我们就很难发现能够区分雷怕霉素及其代谢产物的单克隆抗体。

本发明提供的单克隆抗体对雷怕霉素有高度敏感性。用一个新的致免疫的轭合物进行接种可制得本发明的抗体，该致免疫的轭合物包括与致免疫蛋白连接的新的雷怕霉素衍生物。使用这些抗体的检测试剂盒适合于临床应用，它可以提供比以前更精确、可重复的结果。该抗体还可用于雷怕霉素的纯化和分离。

提供雷怕霉素的免疫抑制衍生物的检测方法面临同样的困难。让人特别感兴趣的是雷怕霉素的40-氧-衍生物，即雷怕霉素环己基环(第40位)上羟基的氧被取代，如在US 5 285 389和PCT/EP93/02604(氧-芳基雷怕霉素和氧-烷基雷怕霉素)中所述(在此引入作为参考)；尤其是40-氧-烷基化的雷怕霉素，其中40-氧-取代基为烷基或取代烷基，如羟烷基、羟烷氧烷基、酰氨烷基、氧烷基、这里“烷基”指支链或直链的C_1-6烷基，优选C_1-6烷基，其中碳链可被醚(-0-)键任意断开；最为特别的是40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素、40-氧-(3-羟丙基)-雷怕霉素、40-0-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷怕霉素，和40-0-(2-乙酰氨基乙基)-雷怕霉素。因此，本发明的另一目的是提供上述40-氧衍生物的单克隆抗体。这些抗体可用于诊断分析，还可用于纯化和生产上述雷怕霉素衍生物。

用于制备本发明新的致免疫轭合物的新的活化的雷怕霉素衍生物是：通过雷怕霉素上的一个羟基基团(优选位于雷怕霉素环己基部分(第40位)上的羟基或第28位上的羟基)使雷怕霉素与一个活化的偶合基团[即该活化的偶合基团能够直接与蛋白质反应生成共价键而不需要应用偶合剂(如碳化二亚胺试剂)]，以实现、引起或促进与蛋白质的反应。该活化的偶合基团最好有一个活化的酯或羧基基团，即，式-CO-O-X，其中X是一个羧基活化的基团，如对-或邻-硝基苯基，1-苯并三唑，五氟苯基或尤其是N-琥珀酰亚胺基。其它合适的活化偶合基团有例如i)可与雷怕霉素连接的活化的联硫基，如式-S-S-Z，其中Z是联硫基活化的基团，如2-吡啶基，或ii)环氧基，如环氧甲基。活化的偶合基团可以通过酯、醚、酰胺、硫或其它合适的键与雷怕霉素连接，但优选酯键。最优选的是带有双酯部分的活化的偶合基团，如琥珀酰，它的一端通过酯键与雷怕霉素连接，另一端有一活化的酯或活化的羧基。

本发明优选的雷怕霉素衍生物是按以下反应I得到的式III：其中式I为雷怕霉素，a)在适当的条件下使式I与-酰化剂反应，并且如果需要脱去保护，得到式II的雷怕霉素，其中y是间隔基基团，优选低级亚烷基，如C_2-6亚烷基，最好是亚乙基，反应a)中的酰化剂可选用例如环酐或二按酸(任意地以半-氧-保护的形式)。b)式II的雷怕霉素与-羧基活化的基团反应，生成式III活化的雷怕霉素，其中羧基活化基团可为HO-X，这里x如前述定义。